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Quel est le statut des extrémités cfDNA ?


Je travaille sur un protocole pour ligaturer le cfDNA, extrait du sang, dans un vecteur. J'ai regardé dans la littérature mais je ne trouve aucun détail sur le statut des extrémités du cfDNA. Sont-ils émoussés ou collants ? Quelle est l'enzyme responsable de la coupure de l'ADN génomique en cfDNA ?

Je sais que je pourrais l'émousser de toute façon et procéder à une ligature émoussée. Cependant, la quantité de cfDNA que j'ai est limitée et j'aimerais éviter les étapes de purification. Donc, s'il s'avérait qu'il est déjà émoussé, j'économiserais une étape dans le processus.

De plus, à part le protocole, j'aimerais vraiment en savoir plus sur les détails moléculaires du cfDNA et sur l'enzyme qui le génère.

Tout indice est très apprécié.


L'ADN sans cellules plasmatiques (cfDNA) comme marqueur prédictif et pronostique chez les patientes atteintes d'un cancer du sein métastatique

Le cancer du sein (CB) est le cancer le plus fréquent chez les femmes, et malgré l'introduction de nouveaux programmes de dépistage, thérapies et technologies de surveillance, il est toujours nécessaire de développer des tests plus utiles pour surveiller la réponse au traitement et éclairer la prise de décision clinique.

Le but de cette étude était de comparer l'ADN acellulaire circulant (cfDNA) et les cellules tumorales circulantes (CTC) avec des biomarqueurs sanguins conventionnels du cancer du sein (CA15-3 et phosphatase alcaline (AP)) en tant que prédicteurs de la réponse au traitement et du pronostic chez les patientes. atteints d'un cancer du sein métastatique (CMB).

Méthodes

Cent quatre-vingt quatorze patientes atteintes d'un MBC confirmé radiologiquement ont été recrutées pour l'étude. Les taux totaux de cfDNA ont été déterminés par qPCR et comparés aux numérations CELLSEARCH® CTC et aux valeurs de CA15-3 et de phosphatase alcaline (AP). Les données des biomarqueurs sanguins ont été comparées aux marqueurs tumoraux conventionnels, au(x) traitement(s) et à la réponse évalués par RECIST et la survie.

Des tests d'hypothèses statistiques non paramétriques ont été utilisés pour examiner les différences, l'analyse de corrélation et la régression linéaire pour déterminer la corrélation et décrire ses effets, la régression logistique et la courbe caractéristique de fonctionnement du récepteur (courbe ROC) pour estimer la force de la relation entre les biomarqueurs et les résultats cliniques et normalisation des valeurs par rapport à l'écart type pour rendre les valeurs des biomarqueurs comparables. L'estimateur de Kaplan-Meier et les modèles de régression de Cox ont été utilisés pour évaluer la survie. Des modèles univariés et multivariés ont été réalisés le cas échéant.

Résultats

L'analyse multivariée a montré que la quantité totale de cfDNA (p valeur = 0,024, HR = 1,199, IC = 1,024-1,405) et le nombre de CTC (p valeur = 0,001, HR = 1,243, IC = 1,088-1,421) sont des prédicteurs de la survie globale (OS), tandis que les niveaux totaux de cfDNA sont le seul prédicteur de la survie sans progression (PFS) (p valeur = 0,042, HR = 1,193, IC = 1,007-1,415) et la réponse de la maladie en comparant la réponse à la non-réponse au traitement (HR = 15,917, HR = 12,481 pour l'analyse univariée et multivariée, respectivement). Enfin, l'analyse combinée des CTC et du cfDNA est plus informative que la combinaison de deux biomarqueurs conventionnels (CA15-3 et AP) pour la prédiction de la SG.

Conclusion

La mesure des niveaux totaux de cfDNA, qui est un biomarqueur plus simple et moins coûteux que le nombre de CTC, est associée à la PFS, à la SG et à la réponse dans le MBC, suggérant une application clinique potentielle d'un test sanguin simple et bon marché.


Une étude révèle les processus de fragmentation de l'ADN, offrant de nouvelles perspectives pour les efforts de biopsie liquide

NEW YORK – Un nouveau rapport de chercheurs de l'Université chinoise de Hong Kong a mis en lumière des informations complètes sur les mécanismes qui définissent la façon dont l'ADN intact des cellules est cisaillé dans les modèles de petits fragments qui circulent dans le sang.

Selon les auteurs, l'étude, publiée dans le numéro de cette semaine du Journal américain de génétique humaine, a résolu des questions jusqu'alors restées sans réponse sur ce processus, ce qui pourrait être utile pour l'optimisation des méthodes actuelles de biopsie liquide et le développement de nouvelles voies pour les tests médicaux à base de sang.

"Nous savons que cfDNA est en fragments courts, mais on ne sait pas grand-chose sur la façon dont ces fragments sont créés", a déclaré l'auteur principal Dennis Lo dans une interview. "Donc, fondamentalement, ce que fait cet article est d'analyser étape par étape les différentes nucléases responsables de la création de fragments [d'ADN]."

Dans l'étude, Lo et ses collègues ont exploré les rôles de trois enzymes - DNASE1, DNASE1L3 et la sous-unité bêta du facteur de fragmentation de l'ADN (DFFB) - en utilisant des modèles murins déficients dans chacune de ces nucléases, dans l'espoir de reconstituer un modèle qui pourrait décrire le processus de fragmentation. qui génère des molécules de cfDNA.

En séquençant les échantillons de sang de souris et en comparant les extrémités des fragments de molécules de cfDNA dans chaque type de souris déficientes en nucléase à celles de souris de type sauvage, le groupe a pu démontrer que chaque nucléase en question a une préférence de coupe spécifique qui suggère une étape par étape. processus de fragmentation du cfDNA.

Sur la base de ce qu'ils ont vu, les chercheurs ont conclu que les fragments de cfDNA semblent d'abord être générés de manière intracellulaire, en présence de DFFB, de DNASE1L3 intracellulaire et d'autres nucléases, puis de manière extracellulaire sous l'influence de la DNASE1L3 et de la DNASE1 circulantes.

Selon Lo et ses coauteurs, les travaux relient définitivement l'action de nucléases distinctes aux profils terminaux des fragments de cfDNA observés dans le cfDNA, "clarifiant la biologie fondamentale et la biographie" de la façon dont ces fragments sont produits.

Avoir une image précise de ce processus de fragmentation pourrait ouvrir de nouvelles applications pour les tests ADN sans cellule, a ajouté Lo dans une interview. D'une part, sachant comment le processus de fragmentation de l'ADN est censé se dérouler, les chercheurs pourraient être en mesure de trouver de nouveaux liens entre une fragmentation aberrante et des conséquences pathologiques ou des états pathologiques particuliers.

De plus, comme la fragmentation du cfDNA a commencé à devenir une caractéristique de diverses méthodes en cours de développement pour la détection précoce du cancer, des informations sur la biologie de ce processus pourraient aider à la validation et à l'analyse comparative de ces méthodes.

S'exprimant lors d'une récente réunion scientifique, l'enquêteur de Johns Hopkins, Viktor Velculescu, a mentionné ce besoin directement, décrivant les méthodes que lui et ses collègues ont développées pour analyser les modèles de fragmentation du cfDNA pour détecter le cancer précoce.

Il a noté à l'époque qu'un défi à la validation technique complète de ces méthodes est le manque de modèles établis qui décrivent quelles nucléases sont impliquées dans la digestion du génome pour créer le cfDNA.

Lo a déclaré que le nouveau travail offre également de nouvelles informations importantes sur la façon dont les variables pré-analytiques telles que le type d'anticoagulant et le délai de séparation du sang peuvent confondre l'analyse cfDNA.

Les expériences que le groupe a réalisées pour créer leur modèle de fragmentation de l'ADN reposaient sur une méthode d'incubation du sang total dans l'EDTA pour induire la mort cellulaire par apoptose in vitro d'une manière qui pourrait imiter le processus de fragmentation et de dissolution du cfDNA dans un organisme réel.

Le sang d'une souris normale traitée de cette manière puis séquencée a révélé des molécules d'ADN cfD plus longues enrichies en fragments d'extrémité A, en particulier des fragments A< >A, A<>G et A< >C avec « une forte périodicité nucléosomique à 200 pb et 400 pb », le auteurs ont écrit.

En revanche, en utilisant du sang de souris déficientes en DFFB, il n'y a pas eu un tel enrichissement. Selon les auteurs, cela implique que DFFB est probablement responsable de la génération de ces fragments d'extrémité A.

Pour étayer l'hypothèse, Lo et ses collègues ont cité la littérature antérieure soutenant DFFB comme jouant un rôle majeur dans la fragmentation de l'ADN au cours de l'apoptose.

« Des études de caractérisation enzymatique ont montré que le DFFB crée des cassures double brin émoussées dans les régions d'ADN internucléosomiques ouvertes, et que ce processus a une préférence pour les nucléotides A et G. motifs dans les fragments A< >A, A< >G et A< >C", ont écrit les chercheurs.

Après avoir établi l'impact du DFFB, le travail de l'équipe n'était pas terminé, car les enquêteurs ont pu voir que le profil typique du cfDNA réellement observé est encore très différent du profil produit par leur processus d'incubation EDTA.

Le cfDNA typique obtenu avant l'incubation tend vers les extrémités C pour toutes les tailles de fragments, par opposition à l'enrichissement de l'extrémité A observé. Ainsi, il devait y avoir une ou plusieurs autres nucléases impliquées, faisant probablement leur travail après la génération de fragments d'extrémité A nouvellement libérés.

Parce qu'ils avaient vu que la prédominance des fragments d'extrémité C était perdue chez les souris déficientes en DNASe1L3, le groupe s'est tourné vers cette enzyme comme coupable probable, mais ils ont voulu déterminer si son activité avait lieu de manière intracellulaire ou en circulation après la libération des fragments initiaux.

En menant des expériences supplémentaires, ils ont vu des preuves de ce qu'ils décrivent comme un processus en deux étapes, l'activité de DNASE1L3 semblant se produire dans les deux contextes.

Enfin, l'équipe a également cherché à comprendre comment une troisième enzyme, la DNASE1, pourrait également agir sur ces processus.

Dans des travaux antérieurs, le groupe a découvert que les profils de taille des fragments cfDNA ne semblaient pas différer entre les souris déficientes en DNASE1 et les souris de type sauvage. Mais selon les auteurs, DNASE1 est connu pour nécessiter une aide protéolytique pour son activité.

Le groupe a décidé d'utiliser l'héparine anticoagulante pour essayer d'imiter la fonction de in vivo protéases. Avec l'incubation d'héparine, ils ont pu constater une augmentation des fragments d'extrémité T dans les échantillons de souris de type sauvage par rapport à des souris déficientes, "principalement parmi les fragments de taille sous-nucléosomique (50 à 150 pb), suggérant que la DNASE1 a un rôle dans la génération de courts <150 pb. fragments."

"Nous pensons que ce premier modèle a inclus un certain nombre de nucléases clés impliquées dans la génération de cfDNA, mais le modèle peut être encore affiné à l'avenir. Par exemple, d'autres nucléases apoptotiques potentielles incluent l'endonucléase G, l'AIF, la topoisomérase II et les cyclophilines, et il y a probablement plus à découvrir", a écrit l'équipe.

Les auteurs ont averti que leur in vitro système d'incubation ne parvient probablement pas à saisir toute la complexité de la in vivo réalité. Cependant, ils ont fait valoir que "les informations générées devraient néanmoins être précieuses".

Un point important à retenir, a déclaré Lo, est qu'en ayant un modèle plus clair de la façon dont ce processus se produit, les chercheurs disposent désormais d'informations importantes sur les éléments qui pourraient le perturber, notamment la durée pendant laquelle les échantillons sont stockés dans des tubes et s'ils sont exposés à l'héparine. quelque chose qui, sur la base de l'étude de l'équipe, devrait modifier considérablement le profil de fragment cfDNA d'un échantillon.

Certes, ne pas connaître ces facteurs de confusion potentiels n'a pas empêché les gens de développer des signatures prédictives utilisant des modèles de fragmentation cfDNA, que ce soit pour des choses comme les tests prénatals non invasifs ou dans le cancer.

D'une certaine manière, a déclaré Lo, ce nouveau schéma permet d'illustrer à quel point le domaine a eu de la chance de réussir jusqu'à présent, "sans connaître tous ces mécanismes".

"Maintenant, le sachant, cela va juste nous aider à faire tout cela beaucoup mieux", a-t-il soutenu.

Enfin, le modèle de l'équipe d'un processus progressif de fragmentation de l'ADN par étapes pourrait permettre de nouvelles recherches cherchant à lier les changements de ce processus normal à d'autres maladies ou troubles.

"Il est possible que certaines conditions puissent modifier les niveaux de nucléase, et cela pourrait être une chose très excitante", a déclaré Lo. Dans un tel cas, la méthode d'analyse des extrémités de fragments du groupe pourrait être appliquée à des échantillons humains, la prévalence de certains nucléotides dans diverses positions d'extrémité montrant quelle nucléase spécifique joue ou ne joue pas son rôle.


Résultats

CfDNA total plus élevé dans le cancer du poumon avec métastases extrathoraciques que sans

Les participants à l' étude sont résumés dans le tableau 1 . La concentration médiane de cfDNA chez 92 patients atteints de cancer du poumon, 18 patients atteints de maladies pulmonaires bénignes et 20 personnes en bonne santé était respectivement de 10,1, 8,0 et 7,5 ng/ml de plasma (Fig 1A), et la différence entre le cancer du poumon et les autres n'était pas statistiquement significatif. Il était un peu plus élevé au stade pathologique IV, mais encore une fois, la différence n'était pas statistiquement significative (figure 1B). Puisque nous avons rapporté que la fréquence de l'ADNct était plus élevée dans les métastases à distance que dans la région intrathoracique sur la base d'une étude observationnelle prospective [13], nous avons comparé des patients avec et sans métastases extrathoraciques. Parmi les patients atteints de cancer du poumon, la concentration médiane de cfDNA total chez ceux avec des métastases extrathoraciques était significativement plus élevée que chez ceux sans métastase (15,0 ng/ml de plasma contre 9,1 ng/ml de plasma), Hodges-Lehmann estime 6,1 (IC à 95 % 1,5& #x0221211.1) pπ.01 (figure 1C). Puisque nous avons récemment montré que la distribution de taille des fragments de cfDNA chez les patients atteints de cancer du poumon est bimodale avec des pics autour de 170 pb (court) et 5 Kb (long) [7], nous avons ensuite analysé par électrophorèse capillaire la quantité de fragments de cfDNA dans chaque classe de taille parmi les patients atteints de cancer du poumon. Une distribution de taille représentative est représentée sur la figure 2A. La molalité de chaque fragment a été mesurée avec un bioanalyseur Agilent comme indiqué précédemment [7]. La molarité médiane du long fragment cfDNA chez les patients atteints d'un cancer métastatique était presque deux fois plus élevée que chez les patients sans métastases (20,0 pmol/l contre 11,1 pmol/l), estimation de Hodges-Lehmann 8,3 (IC à 95 % 0,8�,9 p = 0,031 Fig 2B), alors que la différence de molarité du fragment court cfDNA entre les patients avec et sans métastase était plus petite et non statistiquement significative (880,5 pmol/l vs 523,7 pmol/l Fig 2C). Ces résultats suggèrent la possibilité d'une association entre la présence d'un long fragment cfDNA et des métastases extrathoraciques.

(A) Comparaison de la concentration de cfDNA parmi les trois groupes de participants. (B) Comparaison de la concentration de cfDNA par stade pathologique du cancer du poumon. (C) Comparaison de la concentration de cfDNA chez les patients atteints d'un cancer du poumon en fonction de la présence ou de l'absence de métastases à distance.

(A) Distribution de la taille parmi 5 patients sélectionnés. La distribution de taille des fragments de cfDNA chez les patients atteints de cancer du poumon est bimodale avec des pics autour de 170 pb (court) et 5 Kb (long). Nous avons défini le “short fragment cfDNA” comme un ADN de taille 120

265 pb et fragment “long cfDNA” comme 1000

9000 pb. La concentration et la molarité de chaque région spécifiée ont été normalisées par des tampons marqueurs inférieurs (35 pb) et supérieurs (10380 pb). (B) Comparaison de la molarité du long fragment cfDNA en fonction de la présence ou de l'absence de métastases à distance. (C) Comparaison de la molarité du fragment court cfDNA en fonction de la présence ou de l'absence de métastases à distance.

Tableau 1

Groupern = 130
Patients atteints d'un cancer du poumon92
Adénocarcinome60
Carcinome squameux20
Carcinome non à petites cellules non spécifié ailleurs8
Carcinome à petites cellules4
Organiser42
11
16
22
Inconnu1
Sans métastase extrathoracique73
Avec métastase extrathoracique18
Statut métastatique inconnu1
EGFR statut de mutation (adénocarcinome)
Suppression Ex198
L858R14
Négatif ou inconnu38
Patients atteints d'une maladie pulmonaire bénigne*18
Individus sains20

* Pneumonie bactérienne : 3, Abcès pulmonaire : 1, Maladie mycobactérienne non tuberculeuse : 3, Tuberculose : 2, Aspergillose : 2, Pneumonie cryptogénique organisée : 1, Pneumonie chronique à éosinophiles : 1, Sarcoïdose : 1, Pneumothorax : 1, Autres : 3

Long fragment d'ADN détecté dans la même fraction que les véhicules électriques dans des milieux conditionnés de lignées cellulaires de cancer du poumon

Ensuite, nous avons émis l'hypothèse que les véhicules électriques pourraient jouer un rôle dans la protection du long fragment cfDNA contre la dégradation enzymatique dans le sang. Des études antérieures ont rapporté que la distribution de taille de l'ADN des véhicules électriques dérivés du plasma humain se situe autour de 6 Kb [14]. Les véhicules électriques ont été classés en petits véhicules électriques (exosomes) et grands véhicules électriques (oncosomes) en fonction de leur taille, et ils ont été séparés par centrifugation [15�]. De plus, il a été rapporté que les oncosomes contiennent plus d'ADN à longs fragments d'origine tumorale que les exosomes [10]. Par le protocole illustré à la figure 3A, nous avons pu observer des véhicules électriques avec un microscope électronique à transmission (MET) dans chacune des pastilles 10K et 100K à partir de milieux conditionnés de lignées cellulaires de cancer du poumon. Bien que les pastilles de 10K contenaient des VE petits et grands, les pastilles de 100K ne contenaient que de petits EV (figure 3B). L'analyse par transfert Western de pastilles 10K et 100K dans des lignées cellulaires de cancer du poumon était basée sur CD9 et CD63 en tant que marqueurs de petits EV (exosomes) et BiP et Annexine A1 en tant que marqueurs de grands EV (oncosomes) [10,18]. Les pastilles 10K avaient tendance à contenir moins d'exosomes et plus de gros véhicules électriques que les pastilles 100K (figure 3C). La distribution de la taille de l'ADN des pastilles 10K et 100K dans les lignées cellulaires du cancer du poumon ne comprenait que de longs fragments (figure 3D). Ces résultats montrent que les véhicules électriques petits et grands sont associés à de longs fragments d'ADN dans les lignées cellulaires du cancer du poumon.

(A) Protocole d'isolement d'EV à l'aide de milieux conditionnés de lignées cellulaires de cancer du poumon. (B) Images de pastilles 10K et 100K avec un microscope électronique à transmission (MET). (C) Analyse par transfert Western de pastilles 10K et 100K. 5 μg de lysat EV a été appliqué. Nous avons utilisé des anticorps anti-CD9 et CD63 comme marqueurs de petits véhicules électriques (exosomes) et BiP et Annexine A1 comme marqueurs de grands véhicules électriques. (D) Distribution de la taille de l'ADN parmi les pastilles 10K et 100K.

Fragment court et long cfDNA également détecté dans le plasma de souris présentant des métastases

Ensuite, nous avons cherché à savoir si de longs fragments d'ADN étaient détectés chez des souris présentant des métastases. Nous avons précédemment établi un modèle animal reflétant les cancers du poumon métastatiques humains en utilisant des souris NOD/SCID/Jak3 null (NOJ), qui présentent des déficiences dans l'activité des cellules NK, la fonction des macrophages et des cellules dendritiques, et l'activation du complément, ainsi que des déficiences en cellules T et B [12]. Des cellules H1975 (1휐 7 ) ont été injectées dans les flancs dorsaux de 24 souris NOJ. Six souris ont été sacrifiées mensuellement d'un à quatre mois après l'injection pour évaluer le statut métastatique et la distribution de la taille du cfDNA. Parmi 24 souris, la qualité du cfDNA était suffisamment bonne pour l'analyse de la distribution des tailles chez 20 souris, chez lesquelles 12 des souris avaient des métastases et 8 n'en avaient pas. Par conséquent, nous avons comparé la distribution de taille de cfDNA entre la présence et l'absence de métastase.La distribution de taille de cfDNA provenant d'animaux sans et avec métastases est montrée sur les figures 4A et 4B. Bien que la quantité de fragment court de cfDNA soit négligeable dans le plasma de souris sans métastases, mesurée par électrophorèse capillaire (figure 4A), les fragments courts et longs de cfDNA étaient clairement présents dans le plasma de souris présentant des métastases (figure 4B). L'examen de la quantité a montré que la molarité médiane du long fragment cfDNA chez les animaux avec métastases était plus de deux fois plus élevée que chez les animaux sans métastases (29,9 pmol/l vs 12,2 pmol/l), estimation de Hodges-Lehmann 16,6 (IC à 95 % 2,8 �.6) p = 0,016 (figure 4C). La molarité médiane du fragment court cfDNA chez les animaux avec métastases était sensiblement plus élevée que chez les animaux sans métastases (1185,0 pmol/l contre 103,8 pmol/l), estimation de Hodges-Lehmann 819,6 (IC à 95 % 78,5�,5) p = 0,020 (figure 4D). Ces résultats montrent que l'ADN dérivé des cellules cancéreuses pourrait être dégradé dans le sang périphérique, puisque l'ADNct était contenu dans les deux fragments, ce qui a déjà été rapporté [7].

(A) Distribution de la taille du cfDNA chez la souris sans métastases. (B) Distribution de la taille du cfDNA chez les souris présentant des métastases. (C) Comparaison de la molarité du long fragment cfDNA chez la souris selon la présence ou l'absence de métastases à distance. (D) Comparaison de la molarité du fragment court cfDNA chez la souris en fonction de la présence ou de l'absence de métastases à distance.

Fréquence allélique de la mutation L858R plus élevée dans le cfDNA à fragment court que dans le cfDNA à long fragment

Pour étudier les origines de fragments longs et courts de cfDNA chez l'homme, nous avons séparé le plasma de patients atteints de cancer du poumon avec une mutation L858R par le même protocole de centrifugation que les milieux conditionnés de lignées cellulaires de cancer du poumon (Fig 5A), et nous avons trouvé que le long fragment cfDNA était principalement identifié dans le culot 10K et un court fragment a été détecté dans le surnageant (figure 5B). Pour comparer la quantité d'ADN dérivé de tumeurs à fragments courts et longs chez des patients atteints de cancer du poumon, l'ADN cfD dans le plasma prélevé chez 13 patients dont le cancer présentait des mutations L858R a été séparé en fragments courts et longs par centrifugation. Tout d'abord, nous avons comparé la concentration de cfDNA, la molarité du cfDNA à fragment court, la molarité du cfDNA à long fragment et la molarité du cfDNA à fragments courts et longs combinés parmi les quatre types d'échantillons : plasma, pastilles 10K, pastilles 100K et surnageant (S1 Fig). Deuxièmement, nous avons comparé la corrélation du nombre de copies de L858R détectées par PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) avec les quatre mesures : concentration de cfDNA, molarité du fragment court cfDNA, molarité du fragment long cfDNA et molarité du cfDNA combiné court et long (Fig 5C & #x020135F ). Le nombre de copies de L858R était plus fortement corrélé avec la concentration de cfDNA, la molarité du cfDNA du fragment court et la molarité du cfDNA des fragments court et long combinés qu'avec la molarité du cfDNA du fragment long seul. De plus, la fréquence allélique de la mutation L858R dans le cfDNA du surnageant avait tendance à être la plus élevée parmi tous les types d'échantillons (figure 5G). La fréquence des allèles de la mutation L858R était prononcée dans le cfDNA du surnageant mais effectivement nulle dans les pastilles 10K (13,0% vs 0,0%), estimation de Hodges-Lehmann 12,3 (IC à 95% 1,1�,3) pπ,01 (Fig 5G ). Par conséquent, l'ADN dérivé de tumeurs provenant de patients atteints d'un cancer du poumon est présent en quantités significativement plus élevées dans le cfDNA à fragment court que dans le cfDNA à long fragment.

(A) Le protocole pour isoler des fragments courts et longs de cfDNA dans le plasma de patients atteints de cancer du poumon. (B) Un résultat représentatif de la distribution de taille obtenue avec Bioanalyzer. Les résultats du plasma, du culot 10K, du culot 100K et du surnageant sont présentés. (C-F) Corrélation du nombre de copies de L858R avec les quatre mesures : concentration en cfDNA, molarité du fragment court cfDNA, molarité du long fragment cfDNA et molarité du cfDNA combiné court et long. (G) Comparaison entre les types d'échantillons de la fréquence allélique de EGFR Mutation L858R en utilisant la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR).


Nombre de copies et aberrations structurelles de l'ADN

En plus des mutations, d'autres altérations de l'ADN liées au cancer (telles que les aberrations du nombre de copies [CNA]) et les réarrangements génomiques (inversions, translocations, insertions et délétions) peuvent être étudiées à l'aide de cfDNA. Le CNA peut désormais également être facilement détecté par des méthodes de séquençage massivement parallèles grâce au développement de divers outils analytiques basés sur différentes caractéristiques pouvant être extraites des données NGS (examinées dans la référence 59). On estime que le CNA est présent dans presque tous les cancers de la plupart des types histopathologiques, de sorte que la détection du CNA dans le cfDNA pourrait potentiellement faciliter les applications diagnostiques non invasives. Cependant, l'identification du CNA dans le cfDNA s'est avérée difficile en raison de la prévalence de la variation du nombre de copies dans la population en bonne santé, du niveau variable de la fraction tumorale dans le cfDNA, de la ploïdie tumorale et de l'hétérogénéité tumorale. Actuellement, le CNA dans le cfDNA peut être détecté à l'aide d'un séquençage à faible couverture (0,1 ×) du génome suivi d'algorithmes de normalisation. et de nouveaux algorithmes pour détecter l'ADNc dans une quantité inférieure d'ADNct (inférieure à 1 %) ont été développés au cours des 5 dernières années. 64,65 Encore une fois, la question de savoir si les CNA détectés dans le plasma sont représentatifs du tissu tumoral fait toujours l'objet d'une enquête. Chez les patients atteints de carcinome hépatocellulaire, les CNA dans le plasma étaient comparables en ce qui concerne leur profil de taille, avec ceux trouvés dans le tissu tumoral dans 63 % des bras chromosomiques analysés. 66 En 2018, un nouvel algorithme de détection d'aneuploïdie basé sur l'amplification d'éléments nucléaires longs intercalés (LINEs) a été évalué sur une large cohorte d'échantillons de plasma provenant des stades précoces et tardifs de huit types de cancer différents qui présentaient une fraction cellulaire néoplasique variable. Cinquante-quatre pour cent des échantillons de plasma présentaient un gain ou une perte concordants dans la tumeur primitive. 65 La présence de CNA dans le plasma a également été associée à des résultats cliniques, et leurs analyses ont révélé de nouveaux mécanismes de résistance chez les patients atteints d'un cancer de la prostate ou d'un CBNPC, tels que l'amplification du récepteur aux androgènes (AR) et la fusion TMPRSS2‐ERG ou l'amplification MYC, respectivement. 67,68

Les réarrangements génomiques, notamment ceux impliquant les gènes codant pour les kinases ALK ou ROS, ou la présence de la fusion TMPRSS2-ERG, sont respectivement des cibles thérapeutiques potentielles dans le cancer du poumon ou un biomarqueur de sensibilité pour la réponse au traitement par l'acétate d'abiratérone dans les cancers de la prostate. 69,70 Ces anomalies génomiques structurelles ont le potentiel d'être détectées via des techniques NGS avec l'avantage supplémentaire de détecter un grand nombre de fusions de gènes avec des gènes partenaires connus et inconnus, par rapport aux précédents tests PCR ciblés. En effet, les données obtenues au cours des 1 à 2 dernières années ont montré que le génotypage plasmatique utilisant la technologie NGS à capture hybride peut détecter de manière fiable les fusions ALK ou ROS chez les patients atteints de CPNPC, 71,72 bien que ces résultats doivent être confirmés dans des cohortes de patients plus importantes.


L'ADN acellulaire circulant ou l'ADN tumoral circulant peuvent-ils être un marqueur prometteur dans le cancer de l'ovaire ?

Ces dernières années, les études sur le cancer de l'ovaire ont fait de grands progrès, mais la morbidité et la mortalité des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire sont encore très élevées. En raison du manque d'outils efficaces de dépistage et de détection précoces, 70 % des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire sont diagnostiquées à un stade avancé. Le taux de survie global des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire traitées par chirurgie combinée à une chimiothérapie n'a pas été significativement améliorée, et elles rechutent généralement ou résistent à la chimiothérapie. Par conséquent, un nouveau marqueur tumoral est bénéfique pour le diagnostic et le pronostic des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. En tant qu'indice de « biopsie liquide », l'ADN acellulaire circulant/ADN tumoral circulant (cfDNA/ctDNA) a attiré beaucoup d'attention. Il présente des avantages plus remarquables que les méthodes traditionnelles et offre un large éventail d'applications cliniques dans les types de tumeurs solides. Cette revue tente d'éclairer la valeur importante du cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire, y compris le diagnostic, la surveillance et le pronostic. Pendant ce temps, nous présenterons les orientations futures et les défis pour la détection de cfDNA/ctDNA.

1. Introduction

Le cancer de l'ovaire est la tumeur maligne la plus mortelle du système reproducteur féminin, tandis que le cancer épithélial de l'ovaire est le type le plus courant. Bien que l'incidence du cancer de l'ovaire soit inférieure à celle du cancer du col de l'utérus et du cancer du corps utérin, le taux de mortalité par cancer de l'ovaire se classe au premier rang des tumeurs gynécologiques, ce qui constitue une menace pour la santé et la vie des femmes. En raison des caractéristiques complexes du cancer de l'ovaire et de la localisation de la tumeur dans la cavité pelvienne, les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire précoce n'ont souvent aucun symptôme ou signe évident. Par conséquent, seulement environ 25 % des patientes peuvent être diagnostiquées avant qu'elles ne s'aggravent [1]. Le principal principe thérapeutique du cancer de l'ovaire est la chirurgie, complétée par une chimiothérapie. La chirurgie est l'option préférée pour le cancer de l'ovaire, qui peut mettre en scène des tumeurs, élaborer un plan de traitement et juger du pronostic. La chimiothérapie contribue également au traitement du cancer de l'ovaire, elle est divisée en chimiothérapie néoadjuvante, chimiothérapie postopératoire et chimiothérapie post-rechute. Pour la plupart des patients, le schéma de chimiothérapie principal est une association de platine et de paclitaxel [2]. De plus, il existe des avancées en radiothérapie et immunothérapie ciblées dans le traitement clinique du cancer de l'ovaire avec le bevacizumab (un anticorps IgG1 monoclonal humain recombinant qui agit en inhibant l'activité biologique du facteur de croissance endothélial vasculaire humain) ou la poly ADP-ribose polymérase (PARP) olaparib [3]. Bien qu'ils aient une réponse initiale au traitement et soient sensibles à la chimiothérapie, la plupart d'entre eux ont tendance à récidiver et à produire une résistance aux médicaments chimiothérapeutiques [4] le taux de survie à 5 ans est inférieur à 30 %. Par conséquent, un diagnostic précoce est très important pour surveiller la réponse au traitement et améliorer le pronostic des patients.

L'examen d'imagerie et les marqueurs tumoraux sériques sont largement utilisés comme technologies de diagnostic dans la détection clinique du cancer de l'ovaire. Malheureusement, ces méthodes n'ont pas étudié les normes de sensibilité et de spécificité élevées pour le diagnostic précoce. La mortalité ne différait pas significativement entre les femmes dépistées et celles sans dépistage [5 ]. L'échographie transvaginale a une capacité limitée à distinguer les lésions bénignes des lésions malignes, et il est difficile de trouver de petites tumeurs [6]. La détection de l'antigène cancéreux sérique 125 (CA125) a une faible sensibilité, ce qui rend difficile la détection précoce des lésions. Pendant ce temps, il a également une faible spécificité, car il peut être détecté dans d'autres maladies non malignes, ce qui est susceptible d'entraîner des faux positifs [7]. La biopsie histopathologique [8] est également l'un des outils de diagnostic du cancer de l'ovaire, qui a été considéré comme l'étalon-or. Cependant, il est long et coûteux en plus, il est difficile de prélever et il peut rendre les patients douloureux et risqué de plus, les prélèvements tissulaires ne peuvent pas être appliqués de manière répétée. Sur la base de ce qui précède, il est particulièrement nécessaire de trouver un marqueur tumoral précoce non invasif, répété, avec une sensibilité et une spécificité élevées pour la détection et le diagnostic du cancer de l'ovaire.

La détection de cfDNA/ctDNA est appelée « biopsie liquide », qui est une technologie émergente. La méthode de détection est non invasive et sûre, l'opération est simple et pratique, ne nécessitant qu'une petite quantité de sang pour terminer la détection, et l'échantillon peut être collecté à plusieurs reprises. Le CfDNA/CtDNA peut porter les mêmes changements génétiques et informations épigénétiques que les problèmes tumoraux [9], tels que les mutations ponctuelles, les variations du nombre de copies, la méthylation du promoteur, l'instabilité des microsatellites et la perte d'hétérozygotie. Il peut surmonter l'hétérogénéité tumorale [10], refléter la charge tumorale du corps humain [11], puis refléter de manière dynamique et opportune l'état des patients. Ces caractéristiques font de cfDNA/ctDNA un biomarqueur prometteur.

2. CfDNA/CtDNA

2.1. L'histoire du développement de cfDNA/ctDNA

L'ADNcf est une sorte d'ADN libre qui existe à l'extérieur des cellules et peut être détecté dans le sang, l'urine et d'autres fluides corporels. Mendel et Metais [12] ont découvert pour la première fois la présence de cfDNA dans le sang humain en 1948. Environ 20 ans plus tard, Tan [13] a détecté du cfDNA dans le sérum de patients atteints de lupus érythémateux disséminé. Ensuite, Leon [14] a découvert que les modifications du cfDNA se reflètent dans divers types de cancer. Les niveaux de cfDNA ont augmenté dans le sérum des patients cancéreux, puis ont diminué après le traitement. Si les niveaux de cfDNA restaient élevés, cela pourrait indiquer un manque de réponse à la chimiothérapie. Et les niveaux croissants de cfDNA pourraient être un signe de récidive de la tumeur ou de mauvais pronostic. Depuis lors, il y a eu de plus en plus d'études sur le cfDNA. En 1994, la mutation ponctuelle du gène N-ras a été confirmée dans le cfDNA de patients atteints de syndrome myélodysplasique ou de leucémie aiguë myéloïde [15]. Par la suite, il a été rapporté que des altérations microsatellites [16, 17] et une méthylation des gènes [18, 19] étaient également présentes dans le cfDNA de patients cancéreux, et le cfDNA pourrait être utilisé comme marqueur pour le diagnostic précoce, l'évaluation de l'effet thérapeutique du cancer et le jugement. de pronostic (Figure 1).

2.2. Les sources et les caractéristiques du cfDNA/ctDNA

Pour les individus sains, l'ADN circulant dans le plasma provient de cellules apoptotiques [20]. L'ADN circulant est libéré par des processus physiologiques et peut être éliminé par son propre système, par exemple, les macrophages dans le sang éliminent le matériel libre des cellules endommagées ou mortes, ce qui est un métabolisme normal. Lorsque la tumeur survient, l'apoptose des cellules somatiques est également une source d'ADN circulant, car le schéma trapézoïdal de l'ADN plasmatique ou sérique est similaire à celui des cellules apoptotiques [21]. Outre la libération d'ADN par les cellules tumorales apoptotiques, elle comprend également la libération d'ADN par les cellules tumorales nécrotiques. Par conséquent, la nécrose est une cause importante de la présence de fragments d'ADN. De même, la sécrétion des cellules tumorales peut également libérer de l'ADN [22]. Seule une petite partie de l'ADN circulant des cellules tumorales est donc appelée ADNct. De plus, le fragment d'ADN fœtal libéré dans la circulation maternelle pendant la grossesse est à l'origine du cfDNA [23]. Et le cfDNA peut être dérivé d'une leucolyse, d'une infection, d'un traumatisme et d'une empyrose [24, 25]. Le mécanisme exact du cfDNA libéré des cellules dans la circulation n'est pas encore clair, mais il est certain que le cfDNA ne peut pas être une source unique, mais plusieurs sources. L'ADNcf provenant de différentes sources peut interagir les uns avec les autres, créant des cascades qui libèrent de l'ADN dans la boucle (Figure 2).

L'électrophorèse sur gel d'agarose a montré que l'ADN purifié dans le plasma était un ADN double brin et que les fragments composés peuvent atteindre 21 kb [26]. La concentration d'ADN circulant dans le plasma de personnes en bonne santé est très faible, 6,6 à 5,0 ng/ml, et la longueur moyenne du cfDNA est de 176 pb [20]. Mais la concentration d'ADN circulant est significativement augmentée dans les tumeurs malignes et modérément augmentée dans les maladies bénignes [27]. Les fragments d'ADN plasmatique des patients cancéreux sont plus longs que ceux des patients non cancéreux [28]. Cependant, la longueur du ctDNA est plus courte que le cfDNA (133–144 pb vs 167 pb) [29]. La différence des niveaux de cfDNA peut être liée au type de tumeur, au stade, à la charge tumorale et à d'autres facteurs [30]. Afin de mieux appliquer les cfDNA/ctDNA à la pratique clinique, leurs caractéristiques biologiques doivent encore être explorées en permanence. Ils fournissent une base suffisante et puissante pour la recherche de suivi et contribuent à l'étude de son application clinique.

2.3. Les applications cliniques de cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire

CfDNA/CtDNA joue un rôle important dans la gestion du cancer de l'ovaire. Par conséquent, nous utilisons la base de données PubMed pour collecter des articles pertinents sur les applications cliniques de cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire. Un aperçu des études de recherche sur l'ADNct/ADNct dans le cancer de l'ovaire est résumé (tableau 1).

2.4. La valeur diagnostique du cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire

Ces dernières années, de nombreux chercheurs ont étudié la valeur du cfDNA dans la détection et le diagnostic précoces du cancer de l'ovaire. Par exemple, Shao et al. [31] ont trouvé que les niveaux de cfDNA dans le groupe cancer de l'ovaire étaient significativement plus élevés que ceux du groupe maladie ovarienne bénigne et du groupe contrôle sain. C'était en accord avec le résultat de la recherche Kamat AA′ [32]. Shao et al. [31] ont également constaté que les niveaux de cfDNA étaient significativement augmentés chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire de stade 3-4 par rapport à celles des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire de stade 1-2. L'aire sous la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) était de 0,917, et la sensibilité et la spécificité étaient respectivement de 88,9 % et 89,5 %. La détection du cfDNA était plus sensible et spécifique que les marqueurs tumoraux traditionnels, et les performances diagnostiques peuvent être encore améliorées lors de la détection combinée de ces biomarqueurs. Capizzi et al [33] ont découvert que la détection quantitative du cfDNA peut séparer le cancer de l'ovaire malin de la maladie ovarienne bénigne et des personnes en bonne santé avec une sensibilité de 77 % et une spécificité de 96 %. Pereira et al. [34] ont trouvé que l'ADNc était détecté chez 93,8% des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire et significativement corrélé avec le CA125 sérique et l'examen par tomodensitométrie (TDM). Mais la détection de l'ADNc était plus sensible. Cependant, la méta-analyse de Zhou a révélé que même si la détection quantitative du cfDNA avait une spécificité élevée de 0,90, sa sensibilité était faible à 0,70 [35]. En conclusion, l'analyse quantitative du cfDNA a une sensibilité insatisfaisante mais une spécificité acceptable pour le diagnostic du cancer de l'ovaire. L'expérience de Stamenkovic [36] a révélé que le co-efficacité corrélée entre les valeurs de concentration de cfDNA et d'intégrité de cfDNA était de 0,86 et 0,71. L'aire sous la courbe (AUC) de la concentration de cfDNA était de 0,81, et l'AUC de l'intégrité de cfDNA était de 0,60. Cependant, l'AUC de la détection combinée était de 0,84, obtenant le meilleur effet diagnostique. De même, l'expérience Yu [37] a révélé que la valeur diagnostique de l'AUC pour la concentration en cfDNA était de 0,86 et pour l'intégrité du cfDNA était de 0,72. Lors de leur détection combinée, la valeur diagnostique était de 0,90. Selon, l'effet conjoint du diagnostic est supérieur à la détection unique, le test combiné de la concentration de cfDNA et de l'intégrité du cfDNA était favorable au diagnostic du cancer de l'ovaire. Les raisons des différences des résultats expérimentaux pourraient être liées à une variété de facteurs.Ce n'est que lorsqu'une norme uniforme est atteinte que le cfDNA/ctDNA peut être mieux appliqué à la pratique clinique. Par conséquent, d'autres études sont nécessaires pour analyser les facteurs pouvant influencer la sensibilité et la spécificité diagnostiques du cancer de l'ovaire et pour valider l'efficacité diagnostique de l'utilisation du cfDNA seul ou en combinaison avec des méthodes traditionnelles.

La mutation TP53 est la plus fréquente dans le cancer de l'ovaire séreux de haut grade, représentant plus de 95 % des mutations somatiques [70]. La détection de mutations TP53 dans cfDNA/ctDNA a été rapportée [38-40]. Les études ont montré qu'il y avait les mêmes mutations TP53 dans les tissus du cancer de l'ovaire et les échantillons de sang correspondants. Des mutations de l'ADN d'origine tumorale pourraient être détectées dans le plasma de certaines patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire, en particulier celles atteintes d'un cancer de l'ovaire avancé. Par conséquent, la détection de mutations TP53 dans cfDNA/ctDNA pourrait aider au diagnostic du cancer de l'ovaire et déterminer le degré de malignité du cancer de l'ovaire. Cependant, les performances diagnostiques n'ont pas été rapportées avec différentes méthodes et différentes techniques de détection conduisent à des résultats différents. Il est nécessaire de tester la sensibilité et la spécificité du diagnostic du cancer de l'ovaire. Pendant ce temps, il est nécessaire de déterminer si d'autres mutations liées au cancer de l'ovaire sont appropriées pour le diagnostic. Les études sur les mutations génétiques ont un grand potentiel pour le diagnostic du cancer de l'ovaire.

Les modifications de la méthylation de l'ADN se sont révélées être un événement précoce de la tumorigenèse [71]. La méthylation de l'ADN circulant peut être un marqueur potentiel pour le diagnostic précoce du cancer de l'ovaire [41]. Il y a eu plusieurs changements de méthylation dans les tissus et les échantillons de plasma correspondants du cancer de l'ovaire. Par exemple, Dvorská et al. [42] ont montré que, dans les tissus de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire malin, les niveaux de méthylation du gène CDH1 étaient supérieurs à ceux des témoins sains, et la différence était statistiquement significative. La méthylation du gène CDH1 était également fortement exprimée dans les échantillons de plasma correspondants. Wu et al. [43] ont vérifié que la méthylation anormale de RASSF2A a une fréquence de 51,1 % dans les tissus des patientes atteintes d'un cancer épithélial de l'ovaire et de 36 % dans le plasma, mais n'a pas été détectée dans les tumeurs bénignes ou les individus sains. Swami et al. [44] ont détecté l'hyperméthylation de RASSF1A et BRCA1 dans l'ADNct du carcinome de l'ovaire. Les taux de méthylation étaient respectivement de 31,9% et 56,9%. Cela suggère que le modèle de méthylation du gène dans l'ADN des tissus tumoraux est similaire à celui du cfDNA/ctDNA du cancer de l'ovaire. De plus, par rapport à la détection quantitative, la détection qualitative de la méthylation de l'ADN a une meilleure valeur diagnostique [45]. Wang et al. [46] n'ont montré aucune différence significative dans le niveau de CA125 entre les patientes atteintes d'un cancer épithélial de l'ovaire précoce et les témoins sains par analyse ANOVA unidirectionnelle. Cependant, le niveau de méthylation OPCML du cfDNA était significativement différent chez les patientes atteintes d'un cancer épithélial de l'ovaire précoce par rapport aux témoins sains. Par conséquent, cela soutient l'idée que la méthylation spécifique pourrait identifier le cancer épithélial de l'ovaire chez des individus sains et que la détection de la méthylation du cfDNA était plus sensible et spécifique que les marqueurs traditionnels. Liggett et al. [47] ont trouvé que des différences de méthylation du cfDNA dans RASSF1A, CALCA et EP300 pouvaient distinguer les tumeurs ovariennes malignes du groupe témoin, avec une sensibilité de 90,0% et une spécificité de 86,7%. Widschwendter et al. [48] ​​ont révélé que le schéma de méthylation de l'ADNct, qui distinguait les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade des patientes bénignes et des femmes en bonne santé, avait une sensibilité de 41,4 % et une spécificité de 90,7 %. Ainsi, la méthylation anormale du cfDNA/ctDNA peut être utilisée pour diagnostiquer précocement le cancer de l'ovaire, ce qui a de bonnes perspectives d'application clinique. Mais, la sensibilité et la sensibilité du diagnostic sont différentes. L'analyse des causes des différences est utile pour améliorer l'efficacité du diagnostic, il est nécessaire d'étudier plus avant et de confirmer la valeur diagnostique de la méthylation du cfDNA.

L'instabilité chromosomique est également un signe important du cancer de l'ovaire et peut être détectée dans le cfDNA. Bien qu'il y ait eu peu de rapports sur l'instabilité chromosomique, une étude préliminaire a montré qu'elle est utile pour le diagnostic du cancer de l'ovaire et a un potentiel en recherche clinique. Vanderstichele et al. [49] ont démontré que les mesures d'instabilité chromosomique dans le cfDNA des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire étaient les plus élevées, par rapport aux patientes bénignes et aux témoins sains. En particulier dans le cancer de l'ovaire séreux de haut grade, l'ASC de la détection du cfDNA était de 0,94, la spécificité était de 99,6 % et la sensibilité était 2 à 5 fois supérieure à celle du CA125 et du risque d'index malin. Ainsi, l'instabilité chromosomique du cfDNA peut convenir au diagnostic du cancer de l'ovaire avec une sensibilité et une spécificité élevées.

2.5. La valeur de surveillance du cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire
2.5.1. Réponse à la thérapie

En tant que marqueur largement utilisé pendant le traitement et le suivi, le CA125 a donné de mauvais résultats en application clinique [72]. Inversement, il a été rapporté que le cfDNA/ctDNA pourrait jouer un rôle important dans la réflexion de la réponse thérapeutique des patients cancéreux. Shao et al. ont trouvé que les niveaux de cfDNA augmentaient de manière significative le premier jour après la chirurgie, mais au fil du temps, les niveaux de cfDNA diminuaient progressivement [31]. Cheng et al. [50] ont montré qu'au cours des première et deuxième semaines de radiothérapie, les taux de cfDNA chez onze des patients cancéreux étaient multipliés par huit au cours du temps, puis diminuaient à la fin du traitement. Cependant, les niveaux de cfDNA chez les deux autres patients atteints de cancer ont diminué pendant le traitement. Capizzi et al. [34] ont vérifié que les taux de cfDNA pouvaient différencier significativement avant et après chimiothérapie des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire, ce qui était lié à la situation des patientes après chimiothérapie. Kamat et al. [51] pensaient que l'augmentation des niveaux de cfDNA était liée à l'indice d'apoptose des cellules tumorales. Cependant, au fur et à mesure que l'ADN a été rapidement nettoyé, le cfDNA a progressivement diminué. Il a montré que les niveaux de cfDNA étaient significativement associés à la charge tumorale. À mesure que la charge tumorale augmentait, le cfDNA augmentait également. En un mot, la concentration de cfDNA a augmenté chez les patients cancéreux et a diminué après un traitement efficace. Les variations de la concentration de cfDNA chez les patientes cancéreuses peuvent refléter de manière dynamique le développement et la progression du cancer de l'ovaire. Les changements des niveaux de cfDNA ont une corrélation statistiquement significative avec la réponse au traitement, mais aucune corrélation n'a été démontrée avec l'antigène du carcinome 15-3 (CA15-3), l'antigène du carcinome 19-9 (CA19-9) [52]. De même, l'ADNct pourrait également être appliqué pour évaluer la réponse au traitement de manière dynamique [35], car la concentration d'ADNct ne peut pas être détectée après six mois de traitement initial. Il a suggéré que les patients pourraient bien répondre au traitement. En conséquence, cfDNA/ctDNA pourrait servir de biomarqueur significatif pour surveiller la progression de la maladie et la réponse thérapeutique, en devenant un outil pour refléter la charge tumorale. La surveillance des changements des niveaux de cfDNA peut être bénéfique pour les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire.

L'analyse de l'état des mutations génétiques et des changements de méthylation dans le cfDNA/ctDNA est également utile pour comprendre la réponse des patients au traitement. Arend et al [53] ont indiqué que 38 variations génétiques ont été détectées dans six gènes de l'ADN tumoral avant la chimiothérapie néoadjuvante. Et il y avait 59 mutations dans les dix-neuf gènes du cfDNA. Après la chimiothérapie néoadjuvante, 33 des 38 variations de l'ADN tumoral sont restées inchangées, alors que seulement 6 des 59 mutations étaient présentes dans le cfDNA. Par conséquent, la détection des variations du gène cfDNA peut mieux refléter la réponse à la chimiothérapie chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade. Mais, cela nécessite encore un plus grand nombre de cas pour étendre les tests et déterminer le rôle des mutations cfDNA dans le carcinome de l'ovaire. La mutation TP53 est un marqueur caractéristique du cancer de l'ovaire séreux de haut grade et pourrait refléter l'état des patientes. Après chimiothérapie, les mutations de TP53 dans l'ADNc sérique n'ont pas été détectées, mais sont réapparues au fur et à mesure que la maladie progresse [54]. Les résultats expérimentaux de Kim YM ont montré que la fraction allélique du mutant TP53 dans l'ADNct diminuait significativement après le traitement, et aucune différence significative dans le taux de descente par rapport au CA125 [55]. Cependant, le résultat de la recherche sur le Parkinson CA′ a démontré que l'ADNct répondait au traitement plus tôt que le CA125. Et les patients avec une fraction allélique de la mutation TP53 dans l'ADNc ont diminué de moins de 60 % ont été associés à des effets indésirables [56]. Par conséquent, les mutations de TP53 dans l'ADNct peuvent être un marqueur potentiel pour surveiller la réponse thérapeutique dans le cancer de l'ovaire et avoir une valeur de recherche cruciale. Après la chimiothérapie, les niveaux de méthylation de l'ADNct ont diminué de manière significative [47]. Après chirurgie, des réarrangements chromosomiques spécifiques dans le cfDNA n'ont pas été détectés chez 5/8 patients [57], ce qui suggère une bonne réponse au traitement. Par conséquent, les changements de méthylation et les réarrangements chromosomiques spécifiques pourraient jouer un rôle important en reflétant l'effet thérapeutique. Ils avaient le potentiel pour surveiller la progression de la maladie. Mais, en raison du manque de recherche, il existe peu de rapports sur leur réponse au traitement du cancer de l'ovaire, leur rôle devrait être davantage démontré par un grand nombre d'expériences. En conséquence, l'analyse du cfDNA/ctDNA permet d'évaluer la charge tumorale et de mieux refléter la réponse au traitement, de manière à établir un plan de traitement et à fournir une référence pour un traitement ultérieur. Les études actuelles soutiennent l'importance croissante de la valeur du cfDNA/ctDNA en tant que nouvel outil de surveillance pour les patients pendant le traitement.

2.5.2. Récidive et métastase

Bien que la plupart des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire répondent bien au traitement, les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire avancé ont tendance à rechuter après 1 à 2 ans de traitement. Elle est liée à l'âge des patients, au type histologique, au stade tumoral et à d'autres facteurs. Et le cancer de l'ovaire est sujet à des métastases à 70% de tumeurs malignes qui se propagent aux organes pelviens et abdominaux. L'évaluation de la récidive et des métastases repose principalement sur le CA125 et le CT, mais le CA125 et le CT ne peuvent pas surveiller de manière dynamique et opportune la situation des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire après la récidive, et la détection des lésions métastatiques est également limitée. Cependant, l'utilisation de cfDNA est prometteuse pour surveiller la récidive et les métastases chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. Au cours de la récidive tumorale, les niveaux de PIK3A-H1047 R dans le cfDNA ont augmenté à nouveau, et il y avait une corrélation avec les métastases [58]. Parkinson et al. ont indiqué que les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire en rechute ont des taux d'ADNc plus élevés que celles qui ont un cancer de l'ovaire nouvellement diagnostiqué [56]. Vitale et al. [54] ont démontré que la mutation TP53 était présente dans l'ADN tumoral acellulaire circulant dans le sérum de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade en rechute. Après la chimiothérapie, la mutation TP53 réduite à un niveau indétectable dans l'ADNc, mais augmente à nouveau à mesure que la maladie progresse, la mutation TP53 peut être utilisée comme indicateur de surveillance de la maladie et pour juger de la récidive. Lorsque les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade récidivent, une analyse impartiale du cfDNA pourrait détecter les mutations de réversion BRCA1/2 [59]. Gifford et al. [73] exposent que la méthylation de hMLH1 a augmenté dans l'ADN plasmatique après la chimiothérapie, ce qui indique que les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire ont rechuté. Par conséquent, les changements de cfDNA peuvent refléter la situation des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. En résumé, la détection de la concentration de cfDNA/ctDNA est utile pour la surveillance des métastases et de la récurrence de la tumeur, et les mutations génétiques et les changements de méthylation de cfDNA/ctDNA ont également une grande importance pour le développement et la progression de la tumeur. La surveillance des changements de cfDNA/ctDNA est positive pour le cancer de l'ovaire.

2.5.3. Résistance à la chimiothérapie

La résistance à la chimiothérapie est courante chez les patientes au cours du développement et de la progression des maladies cfDNA/ctDNA dans le traitement du cancer de l'ovaire résistant à la chimiothérapie a un effet important. Steffensen et al. [60] ont prouvé que l'utilisation du bevacizumab contribue au traitement du cancer épithélial de l'ovaire multirésistant. Selon les niveaux de cfDNA, le traitement pourrait être guidé, il pourrait être appliqué comme marqueur d'assistance. Les mutations BRCA1/2 ont pu être détectées dans l'ADNct de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire, qui ont bien répondu à la thérapie ciblée des inhibiteurs de PARP1 [61]. L'étude sur les mutations BRCA1/2 est une percée et fournit un meilleur aperçu de la réponse à la chimiothérapie. Mais les mutations de réversion ont tendance à conduire à une incidence élevée de résistance aux médicaments acquise cliniquement. Les mutations de réversion BRCA1/BRCA2 dans le cfDNA ont été trouvées par analyse de séquençage chez 21 % des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire résistantes au traitement [62]. L'acquisition de mutations de réversion BRCA1/2 était étroitement liée à la résistance au traitement et peut être bénéfique pour prédire la réponse à la chimiothérapie du cancer de l'ovaire, guidant le traitement du cancer de l'ovaire. Cependant, son mécanisme spécifique n'est pas clair. Il est nécessaire d'approfondir l'étude et de vérifier le rôle des mutations de réversion BRCA1/BRCA2 dans le cancer de l'ovaire.

2.6. La valeur pronostique du cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire

Les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire avaient un mauvais pronostic global. Malgré le fait qu'il y ait eu des percées majeures en chirurgie et en chimiothérapie, la survie des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire ne s'est pas améliorée de manière significative. Le taux de survie à 5 ans des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire avancé était significativement inférieur à celui des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire précoce. Par conséquent, des marqueurs tumoraux sont nécessaires de toute urgence pour évaluer le pronostic des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. L'analyse quantitative du cfDNA/ctDNA serait bénéfique pour évaluer le pronostic du cancer de l'ovaire. Lorsque les niveaux de cfDNA dépassent une certaine plage, le risque de décès augmente, ce qui est lié à la diminution du taux de survie des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire [63]. La concentration de RAB25 dans le cfDNA était corrélée à la survie globale et à la survie sans progression. Les faibles niveaux de RAB25 prédisaient une meilleure SSP et une meilleure SG [64], c'était un indicateur pronostique du cancer épithélial de l'ovaire. L'ADNcf a également montré une importance pronostique pour les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire chimiorésistant. Les patients avec des niveaux élevés de cfDNA avaient une SSP et une SG médiocres [60]. Par conséquent, la surveillance des changements des niveaux de cfDNA peut aider à ajuster les schémas thérapeutiques et à observer l'état des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire.

La détection de mutations dans cfDNA/ctDNA a également une valeur importante pour le pronostic du cancer de l'ovaire. La fréquence des mutations somatiques dans le plasma des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire de stade 1 ou 2 était de 68 %. Au fur et à mesure que le stade de la tumeur augmentait, la fraction allèle mutante dans l'ADNc augmentait également. Les patients avec des taux d'ADNc élevés avaient une SSP et une SG médiocres [65]. Un tiers des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire ont une mutation TP53 spécifique à la tumeur dans le plasma, qui a un faible taux de survie. L'ADN tumoral circulant était un prédicteur indépendant de faible survie en analyse multivariée [40]. Les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux avec des anticorps TP53 avaient une faible survie globale [66]. Pendant ce temps, la mutation TP53 dans l'ADNct de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade est associée au stade. Trois mois après la chimiothérapie, la fraction allélique élevée de la mutation TP53 dans l'ADNc indiquait une mauvaise progression [55]. Il y avait un effet pronostique plus significatif que le CA125. Par conséquent, la détection de la mutation TP53 dans cfDNA/ctDNA est précieuse pour juger du pronostic du cancer de l'ovaire. De plus, l'analyse de la mutation TP53 dans l'ADN plasmatique peut déterminer le degré de cancer de l'ovaire malin et est utile pour le suivi postopératoire [38]. La fréquence de la mutation KRAS était particulièrement élevée dans le carcinome mucineux de l'ovaire, et la mutation KRAS était associée à une mauvaise survie globale [66]. La méta-analyse a clarifié la présence d'une mutation KRAS dans le cancer épithélial de l'ovaire, et la mutation KRAS dans cfDNA était associée non seulement à une mauvaise SG mais aussi à une mauvaise PFS [67]. Ainsi, la détection de la mutation KRAS dans le cfDNA a été bénéfique pour le pronostic des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. Ensuite, les chercheurs ont détecté des mutations PI3CA et KRAS dans le cfDNA du carcinome à cellules claires de l'ovaire à l'aide de la ddPCR et ont découvert que les patients présentant des niveaux plus élevés de PIK3CA-H1047 R et KRAS-G12D avaient une SSP plus courte [58]. Les changements de deux indices étaient plus sensibles et rapides que le CA125. Par conséquent, l'évaluation du statut des mutations peut fournir des informations importantes pour le pronostic des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire.

Chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade, il y avait une méthylation d'ERS1 dans les tumeurs primaires et l'ADN tumoral circulant apparié, et la méthylation d'ESR1 avait une cohérence remarquable entre les tumeurs primaires et l'ADN tumoral circulant apparié. La présence de méthylation ESR1 dans les tumeurs primaires était associée à une meilleure SG, PFS et caractéristiques clinicopathologiques, telles que l'âge et le repos tumoral, cependant, il n'y avait pas de corrélation dans l'ADNct [68]. La méthylation du promoteur RASSF1A a également été trouvée chez des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire séreux de haut grade. Les niveaux de méthylation du promoteur RASSF1A dans les tumeurs primaires étaient plus élevés que ceux des tissus adjacents morphologiquement dépourvus de cellules tumorales, et la méthylation du promoteur RASSF1A a également été détectée dans l'ADN tumoral circulant apparié. La méthylation du promoteur RASSF1A dans les tumeurs primitives était liée au grade tumoral et aux métastases ganglionnaires régionales. De plus, la méthylation du promoteur RASSF1A était positivement associée à la SG. Néanmoins, il n'y avait pas de corrélation significative entre la méthylation du promoteur RASSF1A et les caractéristiques clinicopathologiques ou la SG dans les tissus adjacents et les échantillons de plasma appariés [69]. Bien que la méthylation puisse être détectée dans l'ADNct, le rôle de la méthylation dans l'ADNct n'est pas clair. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour comprendre si le cfDNA/tDNA peut prédire l'issue de la maladie et évaluer le pronostic du cancer de l'ovaire. Par la suite, les études ont montré que la méthylation de RASSF1A et BRCA1 était évidente à différents stades et grades du cancer de l'ovaire et pourrait avoir un potentiel en tant que marqueur pronostique chez les patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire. La présence de méthylation de hMLH1 dans l'ADN plasmatique de patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire en rechute était associée à une mauvaise SG et était indépendante de l'âge, de la durée de la maladie et d'autres facteurs. Ainsi, les changements de méthylation de l'ADN dans le cfDNA ont fourni un potentiel pour le pronostic des patientes atteintes d'un cancer de l'ovaire [73]. Il existe peu d'études sur la valeur pronostique de la méthylation cfDNA/ctDNA dans le cancer de l'ovaire, et le mécanisme par lequel la méthylation se produit dans le sang n'est pas clair. En un mot, des efforts supplémentaires sont nécessaires pour cribler la méthylation spécifique et confirmer l'importance de la méthylation cfDNA/ctDNA dans le pronostic du cancer de l'ovaire.

3. Orientations et défis futurs

Avec le développement et l'innovation continus de la technologie, cfDNA est devenu un axe de recherche dans le domaine médical et a une large perspective d'application. CfDNA/ctDNA présente des avantages évidents par rapport aux méthodes traditionnelles. Il peut non seulement être utilisé pour le dépistage prénatal [74], l'analyse des maladies immunitaires [75, 76], mais a également une valeur clinique très importante en oncologie. Il a été rapporté dans le cancer colorectal, le cancer du sein, le cancer du poumon non à petites cellules et d'autres tumeurs [77-82]. La valeur du cfDNA/ctDNA peut être démontrée et utilisée par le diagnostic, le suivi de la réponse thérapeutique, la récurrence et la résistance aux médicaments, et le pronostic. CfDNA/ctDNA est un marqueur prospectif qui fournit des preuves importantes pour la recherche clinique et l'application.

Bien que le développement de la « biopsie liquide » ait fait d'énormes progrès, il reste confronté à de nombreux défis. Si cfDNA/ctDNA doit être utilisé efficacement en clinique, certains problèmes doivent être résolus. Par exemple, la source exacte et le mécanisme de cfDNA/ctDNA ne sont pas clairs, ce qui affectera les recherches ultérieures. Les problèmes de collecte et de traitement des échantillons, d'extraction de cfDNA/ctDNA et d'analyse des résultats interféreront également avec les résultats de l'expérience. Différents sujets expérimentaux ont été sélectionnés et différentes méthodes et techniques de test ont été utilisées, ce qui a donné des résultats différents.La sensibilité et la spécificité de la détection doivent encore être améliorées. Par conséquent, il doit encore faire des efforts pour développer des procédures standardisées pour une application précoce dans les essais cliniques.

4. Conclusions

Non seulement la détection de la concentration et de l'intégrité, mais aussi les mutations génétiques et les changements de méthylation ont été rapportés dans le cfDNA/ctDNA du cancer de l'ovaire. En tant que nouveau marqueur tumoral, le cfDNA/ctDNA joue un rôle clé dans l'application clinique. Il peut être utilisé pour dépister et détecter des tumeurs et évaluer le pronostic, les effets thérapeutiques et la réponse aux médicaments chimiothérapeutiques. Cependant, la valeur de cfDNA/ctDNA doit encore être explorée en permanence. À l'avenir, cfDNA/ctDNA a un énorme potentiel de développement et de larges perspectives d'application clinique. Des efforts supplémentaires sont nécessaires pour introduire le cfDNA/ctDNA dans la pratique clinique à une date précoce.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts.

Contributions des auteurs

M Y, Y Z, LC T, JL C et YJ S ont contribué à la rédaction, à la révision et à l'édition. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Remerciements

L'étude a été financée par des subventions de la Fondation des sciences naturelles de la province du Heilongjiang, en Chine (n° H2018049).

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Droits d'auteur

Copyright © 2021 Ming Yu et al. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation, une distribution et une reproduction sans restriction sur n'importe quel support, à condition que l'œuvre originale soit correctement citée.


Discussion

Nous avons démontré que le profilage des motifs terminaux de l'ADN plasmatique représente une approche pour différencier les patients avec et sans cancer. En raison de la petite taille de l'échantillon de ce travail de validation de principe, ces résultats devraient être validés dans des études à grande échelle. Plusieurs éléments de preuve provenant d'études antérieures ont suggéré que la fragmentation de l'ADN plasmatique est un processus non aléatoire. Par exemple, les fragments d'ADN plasmatique présentent une distribution de taille caractéristique avec un pic majeur de 166 pb et des pics plus petits apparaissant à des intervalles de 10 pb (2) il existe un grand nombre d'emplacements génomiques qui sont préférentiellement clivés (4, 5) lorsque le plasma Des ADN sont générés et la fragmentation de l'ADN plasmatique a permis de déduire des empreintes nucléosomiques (2, 3). Dans cette étude, nous montrons que certains motifs terminaux de l'ADN plasmatique sont plus répandus que d'autres, en association avec le tissu d'origine. D'autre part, les aberrations de motifs associées au cancer sont présentes chez les patients atteints de cancer.

Une observation clé du profil des motifs terminaux de l'ADN plasmatique chez les patients atteints de CHC était qu'il y avait une augmentation de la diversité des motifs chez ces patients. Considérant le fait que DNASE1L3 joue un rôle important dans la fragmentation de l'ADN plasmatique comme le démontre un Dnase1l3 modèle de souris de suppression (16), une raison possible serait due à la régulation négative significative de DNASE1L3 dans les tissus tumoraux du foie humain. Suppression Dnase1l3 entraînerait une réduction spectaculaire des six motifs terminaux les mieux classés (par exemple, CCCA) qui étaient à l'origine fortement enrichis chez les souris de type sauvage (16). Nous avons observé une diminution significative de DNASE1L3 dans les tumeurs HCC et d'autres types de cancer (cancer du sein, cancer du côlon, cancer du poumon, cancer gastrique et carcinome épidermoïde de la tête et du cou) qui ont été analysés dans ce travail et disponibles dans la base de données TCGA (Fig. supplémentaire S3C). Nous avons observé que le motif terminal de l'ADN plasmatique CCCA était réduit dans le groupe HCC par rapport au groupe sans HCC. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que les activités enzymatiques de DNASE1L3 peuvent contribuer en partie aux altérations de la diversité des motifs de l'ADN plasmatique.

Curieusement, les valeurs MDS à travers un large spectre de tailles d'ADN plasmatique pour les patients atteints de CHC sont plus grandes que celles des sujets non-HCC. Nous n'avons pas observé d'amélioration différentielle des performances diagnostiques basées sur le MDS en nous concentrant sur des molécules d'ADN plasmatiques plus courtes sélectionnées. Dans le modèle murin susmentionné, les profils d'ADN plasmatique de souris gravides dans lesquelles les deux copies de Dnase1l3 avait été supprimé (c'est-à-dire Dnase1l3 −/− réf. 16) ont été étudiées. Si une telle enceinte Dnase1l3 −/− souris porteuses de foetus du Dnase1l3 +/− (c'est-à-dire avec une copie de la notice de fonctionnement Dnase1l3 gène), les fœtus ont pu corriger partiellement le profil d'ADN plasmatique des mères enceintes (16), ce qui implique que les fœtus ont pu libérer l'enzyme DNASE1L3 dans la circulation de la mère pour modifier les motifs terminaux de l'ADN plasmatique de la mère. Ainsi, nous supposons que l'observation de l'élévation des valeurs de MDS dans différentes gammes de taille chez les patients atteints de CHC pourrait être associée à une altération de l'expression des gènes impliquant des gènes codant pour les nucléases, par exemple, une réduction de l'expression de DNASE1L3. Une telle altération de l'expression génique de ces nucléases pourrait entraîner une perturbation des niveaux relatifs de différentes nucléases dans le plasma, entraînant un changement global des motifs terminaux de l'ADN plasmatique (c'est-à-dire affectant à la fois l'ADN plasmatique tumoral et non tumoral des motifs terminaux). Nous avons appelé ce changement global l'effet « systémique » de la perturbation de la nucléase.

De plus, dans l'étude précédente de modèles de souris gravides, une coupure d'ADN améliorée par l'enzyme DNASE1L3 exprimée par les fœtus a été observée dans le sous-ensemble de molécules d'ADN fœtal, indiquant un effet « local » (c'est-à-dire dans les tissus fœtaux) de DNASE1L3. Un tel effet « local » analogue semblait également exister dans le sous-ensemble de molécules d'ADN plasmatique portant des mutations tumorales. Par conséquent, nous pensons que les effets "globaux" et "locaux" des nucléases peuvent affecter le profil fragmentomique de l'ADN plasmatique. La base mécanistique de cette observation nécessite une enquête future, par exemple, en utilisant un modèle de souris avec knockdown ou surexpression de différentes nucléases dans différents tissus.

Nous avons supposé qu'un certain nombre d'autres nucléases, telles que la DNase activée par la caspase, la DNASE II, TREX1 (exonucléase à trois réparations principales), la DNASE1 et l'ENDOG (endonucléase G), impliquées dans les fragmentations de l'ADN pendant l'apoptose pourraient être impliquées dans la génération de l'ADN plasmatique se termine. Dans notre étude précédente, nous avons constaté que la suppression de Dnase1l3 entraînerait des aberrations du profil de taille de l'ADN plasmatique, alors qu'il n'y avait aucun effet observable sur le profil de taille de l'ADN plasmatique pour les souris avec la suppression de Dnase1 (16). Par conséquent, nous proposons que DNASE1L3 peut jouer un rôle dans la génération de motifs terminaux d'ADN plasmatique. Notre groupe explore maintenant l'effet de la délétion de gènes codant pour un certain nombre des nucléases susmentionnées sur les motifs terminaux de l'ADN plasmatique (25). De tels travaux en cours pourraient apporter de nouvelles connaissances mécaniques sur la génération de motifs terminaux cfDNA. La fragmentation de l'ADN se produisant avec l'apoptose cellulaire serait probablement affectée par le profil nucléosomique de différentes régions génomiques, qui pourrait varier d'un tissu à l'autre (3, 20), contribuant potentiellement à la variation des profils de motifs terminaux de différents tissus.

Ces données présentées dans cette étude suggèrent que le profil des motifs terminaux de l'ADN plasmatique pourrait refléter certains états physiopathologiques. Une telle hypothèse était en outre mise en évidence par le fait que le profil des motifs terminaux de l'ADN plasmatique provenant du même type de tissu, tels que le foie, le placenta et les cellules hématopoïétiques, était généralement regroupé. Par exemple, les motifs terminaux permettraient de regrouper les molécules d'ADN plasmatique fœtal (c'est-à-dire provenant du placenta) et maternelle (principalement d'origine hématopoïétique) en différents groupes dans l'ADN plasmatique des femmes enceintes. De plus, les molécules d'ADN spécifiques du foie et du receveur ont montré des motifs uniques de motifs terminaux. Pris ensemble, le profil des motifs terminaux de l'ADN plasmatique représente une nouvelle classe de biomarqueurs pour la biopsie liquide pour l'oncologie, les tests prénatals non invasifs et la surveillance des transplantations.

Comme démontré dans les analyses de sous-échantillonnage présentées sur la figure 3H, le potentiel diagnostique de l'analyse du motif final de l'ADN plasmatique ne nécessite qu'un nombre relativement faible de molécules à réaliser. Ainsi, pour des fractions d'ADN tumoral de 5 % et 10 % respectivement, le plateau de performance serait atteint à 500 000 et 50 000 molécules. Nous considérons que cette observation reflète une force potentielle de l'approche basée sur les motifs, en ce sens qu'à l'avenir, on pourrait adapter cette approche à des méthodes analytiques à plus faible débit, mais moins chères, par exemple, la PCR numérique.

En résumé, nous avons développé une approche générique pour délimiter le profil des motifs terminaux de l'ADN plasmatique et avons révélé son association avec des conditions physiopathologiques telles que la grossesse, la transplantation et le cancer. En tant que membre du domaine émergent de la fragmentomique de l'ADN plasmatique qui englobe également le profilage de la taille de l'ADN plasmatique (2), les extrémités préférées (4, 5) et les relations nucléosomales (2, 3), nous pensons que le profilage des motifs terminaux de l'ADN plasmatique aurait de nombreuses futures applications de recherche et de diagnostic.


L'ADN sans cellules cartographie les lésions tissulaires du COVID-19 et le risque de décès et peut provoquer des lésions tissulaires

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4 Base de bioinformatique et de calcul, NHLBI, Maryland, États-Unis.

5 Bureau du directeur, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

6 Advanced Lung Disease and Transplant Program, Inova Fairfax Hospital, Fairfax, Virginie, États-Unis.

7 Département de médecine, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Sean Agbor-Enoh, Laboratory of Applied Precision Omics, Genomic Research Alliance for Transplantation (GRAfT), Division of Intramural Research, National Heart, Lung and Blood Institute, 10 Center Dr., Rm 7D5, Bethesda, Maryland 20892, ETATS-UNIS. Téléphone : 703.677.4630 Courriel : [email protected]

Note d'auteur : TEA et NT ont contribué à parts égales à ce travail.

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6 Advanced Lung Disease and Transplant Program, Inova Fairfax Hospital, Fairfax, Virginie, États-Unis.

7 Département de médecine, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Sean Agbor-Enoh, Laboratory of Applied Precision Omics, Genomic Research Alliance for Transplantation (GRAfT), Division of Intramural Research, National Heart, Lung and Blood Institute, 10 Center Dr., Rm 7D5, Bethesda, Maryland 20892, ETATS-UNIS. Téléphone : 703.677.4630 Courriel : [email protected]

Note d'auteur : TEA et NT ont contribué à parts égales à ce travail.

1 Genomic Research Alliance for Transplantation (GRAfT) et Laboratory of Applied Precision Omics, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

2 Département de biologie, Université Howard, Washington DC, États-Unis.

3 Unité de diagnostic rénal et thérapeutique, Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

4 Base de bioinformatique et de calcul, NHLBI, Maryland, États-Unis.

5 Bureau du directeur, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

6 Advanced Lung Disease and Transplant Program, Inova Fairfax Hospital, Fairfax, Virginie, États-Unis.

7 Département de médecine, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, États-Unis.

Adressez la correspondance à : Sean Agbor-Enoh, Laboratory of Applied Precision Omics, Genomic Research Alliance for Transplantation (GRAfT), Division of Intramural Research, National Heart, Lung and Blood Institute, 10 Center Dr., Rm 7D5, Bethesda, Maryland 20892, ETATS-UNIS. Téléphone : 703.677.4630 Courriel : [email protected]

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1 Genomic Research Alliance for Transplantation (GRAfT) et Laboratory of Applied Precision Omics, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

2 Département de biologie, Université Howard, Washington DC, États-Unis.

3 Unité de diagnostic rénal et thérapeutique, Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

4 Base de bioinformatique et de calcul, NHLBI, Maryland, États-Unis.

5 Bureau du directeur, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

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7 Département de médecine, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, États-Unis.

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2 Département de biologie, Université Howard, Washington DC, États-Unis.

3 Unité de diagnostic rénal et thérapeutique, Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

4 Base de bioinformatique et de calcul, NHLBI, Maryland, États-Unis.

5 Bureau du directeur, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

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2 Département de biologie, Université Howard, Washington DC, États-Unis.

3 Unité de diagnostic rénal et thérapeutique, Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales (NIDDK), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

4 Base de bioinformatique et de calcul, NHLBI, Maryland, États-Unis.

5 Bureau du directeur, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

6 Advanced Lung Disease and Transplant Program, Inova Fairfax Hospital, Fairfax, Virginie, États-Unis.

7 Département de médecine, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, États-Unis.

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1 Genomic Research Alliance for Transplantation (GRAfT) et Laboratory of Applied Precision Omics, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

2 Département de biologie, Université Howard, Washington DC, États-Unis.

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4 Base de bioinformatique et de calcul, NHLBI, Maryland, États-Unis.

5 Bureau du directeur, NIDDK, NIH, Bethesda, Maryland, États-Unis.

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7 Département de médecine, École de médecine de l'Université Johns Hopkins, Baltimore, Maryland, États-Unis.

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INTRODUCTION. L'évolution clinique du coronavirus 2019 (COVID-19) est hétérogène, allant d'une défaillance multiviscérale légère à grave et la mort. Dans cette étude, nous avons analysé l'ADN acellulaire (cfDNA) en tant que biomarqueur de lésion pour définir les sources de lésion tissulaire qui contribuent à ces différentes trajectoires.

MÉTHODES. Nous avons mené une étude de cohorte prospective multicentrique pour recruter des patients atteints de COVID-19 et collecter des échantillons de plasma. Le cfDNA plasmatique a été soumis à un séquençage au bisulfite. Une bibliothèque de signatures de méthylation d'ADN spécifiques aux tissus a été utilisée pour analyser les lectures de séquences afin de quantifier le cfDNA de différents types de tissus. Nous avons ensuite déterminé la corrélation des mesures cfDNA spécifiques aux tissus avec les résultats de COVID-19. Des analyses similaires ont été effectuées pour des témoins sains et un groupe de comparaison de patients atteints du virus respiratoire syncytial et de la grippe.

RÉSULTATS. Nous avons trouvé des niveaux nettement élevés et des sources tissulaires divergentes de cfDNA chez les patients COVID-19 par rapport aux patients qui avaient la grippe et/ou le virus respiratoire syncytial et avec des témoins sains. Les principales sources de cfDNA dans COVID-19 étaient les cellules hématopoïétiques, l'endothélium vasculaire, les hépatocytes, les adipocytes, les reins, le cœur et les poumons. Les niveaux de cfDNA étaient positivement corrélés avec la gravité de la maladie COVID-19, la protéine C réactive et les D-dimères. Le profil cfDNA à l'admission a identifié les patients qui ont par la suite nécessité des soins intensifs ou sont décédés pendant l'hospitalisation. De plus, l'augmentation du cfDNA chez les patients COVID-19 a généré un excès de ROS mitochondriaux (mtROS) dans les cellules tubulaires rénales d'une manière dépendante de la concentration. Cette production de mtROS a été inhibée par un antagoniste spécifique de TLR9.

CONCLUSION. cfDNA cartographie les lésions tissulaires qui prédisent les résultats de COVID-19 et peuvent propager mécaniquement les lésions tissulaires induites par COVID-19.

LE FINANCEMENT. Subvention intra-muros ciblée anti-COVID-19, NIH.

La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est une pandémie mondiale causée par le nouveau coronavirus 2 du SRAS (SARS-CoV-2) qui a entraîné 71,3 millions de cas confirmés et plus de 1,6 million de décès au 12 décembre 2020 (1). Les symptômes sont souvent légers ou absents au début de la maladie. Les trajectoires cliniques ultérieures varient considérablement, imposant des défis importants aux ressources de soins de santé, la plupart des patients infectés par le SRAS-CoV-2 développent des maladies bénignes, se rétablissant rapidement et sans avoir besoin d'être hospitalisés, tandis que d'autres développent une maladie grave nécessitant une hospitalisation. Dans ce dernier groupe, certains patients nécessitent une admission en médecine générale et d'autres ont une maladie évolutive qui nécessite des soins en unité de soins intensifs (USI) (2). Bien que le poumon soit le lieu prédominant des infections graves au SRAS-CoV-2, plusieurs organes et tissus peuvent être impliqués (3, 4), y compris des dommages étendus au système vasculaire, au cœur, aux reins et à d'autres organes (5, 6). Les sources de lésions tissulaires qui contribuent à ces différentes trajectoires cliniques restent mal définies.

Dans plusieurs maladies, l'ADN acellulaire (cfDNA), y compris nucléaire (ncfDNA) et mitochondrial (mtcfDNA), est libéré dans la circulation après apoptose, nécrose et sécrétion active des cellules (7). Chez un individu sain, le cfDNA est présent en petites quantités (8), a une courte demi-vie (9) et est principalement dérivé des cellules hématopoïétiques circulantes. La composition et la quantité de cfDNA changent considérablement au cours des conditions pathologiques. En effet, plusieurs études ont signalé une concentration élevée de cfDNA en tant que biomarqueur non invasif potentiel dans de nombreuses maladies (10) et le rejet de greffe (11-13). De plus, les biomarqueurs cfDNA ont le potentiel de détecter la maladie avant que des manifestations cliniques ou des changements histopathologiques ne se développent, comme dans le cas du rejet de greffe. De plus, la concentration de cfDNA circulant prédit les résultats à long terme de la transplantation pulmonaire et d'autres maladies. Étant donné que le cfDNA conserve les signatures de méthylation de ses tissus d'origine (14, 15), l'analyse méthylomique du cfDNA peut permettre de cartographier les sources de lésions tissulaires qui contribuent et prédisent différentes trajectoires cliniques de COVID-19.

Au-delà de l'infection directe des cellules par le SRAS-CoV2, les déclencheurs ultérieurs de lésions tissulaires ou organiques restent mal définis dans COVID-19. Bien que le récepteur du SRAS-CoV-2, l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), soit exprimé dans les poumons, le cœur, les reins, l'intestin et l'endothélium vasculaire (5, 16-20), des lésions sont souvent détectées dans ces tissus sans particules virales (21). De plus, des lésions ont également été détectées dans des cellules de types qui n'expriment pas le récepteur ACE2, impliquant des déclencheurs non viraux de lésions tissulaires (22). Des études récentes ont rapporté que le dérèglement de la réponse immunitaire et l'inflammation incontrôlée sont associés à des lésions tissulaires dans COVID-19 (23, 24), telles qu'une augmentation de la réponse IFN de type I des macrophages pro-inflammatoires dérivés des monocytes (25) et une élévation du TNF-α, IL- 6, et la production d'IL-8 (26, 27). Cependant, on sait peu de choses sur les facteurs moteurs qui conduisent à une inflammation excessive chez les patients COVID-19.

En plus d'être un biomarqueur des lésions tissulaires, le cfDNA peut agir comme un motif moléculaire associé au danger (DAMP) et aggraver l'inflammation (28). mtcfDNA, contenant de courts îlots sans nucléosome et à CpG élevé (29), se lie à TLR9 et déclenche une réponse pro-inflammatoire. Nous avons également précédemment montré que l'ADNmtcf contribue à la production de cytokines, à l'apoptose et aux lésions mitochondriales tubulaires via TLR9 dans les lésions rénales aiguës induites par la septicémie (AKI, réf. 30). De plus, le cfDNA circulatoire a également été impliqué dans l'activation de la coagulation et la formation de thrombus chez les patients atteints de sepsis (31). Des études récentes ont également signalé des niveaux élevés de cfDNA chez les patients COVID-19 qui sont fortement corrélés avec les réactifs de phase aiguë, le nombre de neutrophiles et la progression de la maladie (32).Le cfDNA est également un composant essentiel des pièges extracellulaires dérivés des neutrophiles (NET), qui sont élevés chez les patients COVID-19 (32-34).

Dans cette étude, nous avons utilisé le cfDNA pour cartographier les sources de lésions tissulaires en corrélation avec les trajectoires et les résultats cliniques de COVID-19 et évalué si le cfDNA libéré avec COVID-19 peut agir comme un DAMP.

Démographie et caractéristiques cliniques des patients atteints de COVID-19. Nous avons recruté 85 patients atteints de COVID-19 (tableau 1 et figure 1) et les avons regroupés selon la gravité maximale de leur maladie au cours de leur maladie COVID-19 à l'aide de l'échelle de l'OMS, une mesure d'échelle ordinale à 8 points pour l'amélioration clinique, qui est basée sur la santé. utilisation des ressources de soins et décès (35). La cohorte comprenait 18 patients non hospitalisés (échelle OMS 1, 2) et 67 patients hospitalisés, dont 21 patients hospitalisés ne nécessitant pas de soins en USI (échelle OMS 3, 4) et 46 patients nécessitant des soins en USI (échelle OMS 5 à 8) pendant leur COVID-19. maladie. L'âge médian (IQR) était de 48,5 (37-56 ans) et 64,7% étaient des hommes. La plupart des patients hospitalisés (n = 52, 77,6%) avaient au moins 1 comorbidité sous-jacente : hypertension (n = 27, 41%), diabète sucré (n = 28, 42,4%) et l'obésité (n = 25, 37,9%) étaient les plus fréquentes. Le sexe et la race ont montré une différence significative entre les patients en soins intensifs et les autres patients. Dix-huit patients hospitalisés (27,4 %) sont décédés. De plus, 21 patients infectés par la grippe et/ou le virus respiratoire syncytial (VRS) ont été inclus comme groupe de comparaison. Ce groupe a été apparié pour la gravité de la maladie à l'aide de l'échelle de l'OMS pour la progression de la maladie (tableau supplémentaire 1 matériel supplémentaire disponible en ligne avec cet article https://doi.org/10.1172/jci.insight.147610DS1). Nous avons également inclus 32 témoins sains.

Diagramme montrant la sélection des patients et les expériences. Sur 85 patients inscrits atteints de COVID-19 (67 hospitalisés et 18 non hospitalisés), 6 patients hospitalisés ont été exclus de l'analyse pour absence d'échantillons d'admission. Le ncfDNA et le mtcfDNA totaux ont été quantifiés chez tous les sujets de l'étude par PCR numérique en gouttelettes (ddPCR). Un sous-ensemble de patients hospitalisés (n = 50 : 30 ICU et 20 non-ICU) ont été soumis à un séquençage au bisulfite du génome entier (WGBS). Parmi les 32 témoins sains recrutés, la ddPCR et la WGBS ont été réalisées respectivement chez 31 et 19 témoins sains. Tous les patients atteints de grippe ou de VRS ont été soumis à la ddPCR et au WGBS.

Données démographiques et cliniques des patients atteints de COVID-19

Niveaux élevés de cfDNA chez les patients COVID-19. Nous avons quantifié le total (en vrac) et le mtcfDNA par PCR numérique en gouttelettes et avons ensuite effectué un séquençage au bisulfite et analysé les lectures de séquences de cfDNA à l'aide d'un algorithme de déconvolution et d'une bibliothèque de signatures de méthylation d'ADN spécifiques aux tissus pour étudier les sources de cfDNA chez les patients atteints de COVID-19, patients avec la grippe et/ou le VRS, et des témoins sains (Figure 2). L'infection au COVID-19 est nettement plus élevée (20 fois) totale (en vrac) de ncfDNA (47 500 copies/mL) par rapport aux témoins sains (2 320 copies/mL, P < 0,0001, figure 3A). De même, les patients COVID-19 avaient un mtcfDNA 250 fois plus élevé que les témoins sains (figure 3B). Dans l'ensemble, les cellules hématopoïétiques étaient les principaux contributeurs de cfDNA dans le groupe COVID-19 (

90,5%), les neutrophiles, les cellules progénitrices des érythrocytes et les monocytes étant les principaux contributeurs. La source tissulaire de cfDNA était différente chez les patients COVID-19 par rapport aux témoins sains. Nous avons trouvé des niveaux de cfDNA 35 à 390 fois plus élevés dérivés des cellules hématopoïétiques chez les patients COVID-19 par rapport aux témoins sains, y compris les monocytes (14 000 contre 208 copies/mL), les neutrophiles (43 250 contre 531 copies/mL), les érythroblastes ( 19 160 vs 535 copies/mL) et lymphocytes (3 680 vs 65 copies/mL) P < 0,0001 pour toutes les comparaisons (Figure 3, C–F). De même, les niveaux de cfDNA dérivé de tissus non hématopoïétiques étaient environ 10 à 1000 fois plus élevés chez les patients COVID-19 que chez les témoins sains. Parmi ceux-ci, cfDNA dérivé de l'endothélium vasculaire (2 480 vs 30 copies/mL), adipocytes (2795 vs 44,2 copies/mL), hépatocytes (6 860 vs 15,3 copies/mL), pancréas (762 vs 7,9 copies/mL) ), vessie (915 vs 2,8 copies/mL), intestin (745 vs 6,1 copies/mL), rein (1 152 vs 15,1 copies/mL), cœur (1824 vs 42,5 copies/mL), poumon (1098 vs 1,25 copies/mL) et le larynx de la tête et du cou (715 contre 21,7 copies/mL) étaient plus élevés chez les patients COVID-19 que chez les témoins sains P < 0,0001 pour toutes les comparaisons (Figure 3, G–P).

Concentrations absolues de cfDNA provenant de différents types de tissus chez les patients. Graphique de la carte thermique montrant le regroupement non supervisé des concentrations de cfDNA provenant de différentes sources tissulaires (copies/mL à l'échelle logarithmique), chaque colonne représentant des patients individuels, qui incluent des patients COVID-19 (n = 55, noir), témoins sains (n = 19, bleu) et un groupe de comparaison de patients atteints de la grippe ou du virus respiratoire syncytial (n = 21, orange). Les cfDNA de types de tissus individuels ont été quantifiés par séquençage au bisulfite, en analysant les signatures de méthylation de l'ADN spécifiques aux tissus. La concentration de cfDNA est représentée en copies/mL de plasma et rapportée sur une échelle logarithmique des valeurs les plus faibles (bleu) aux valeurs les plus élevées (rouge).

La concentration circulante de cfDNA est nettement élevée chez les patients atteints de COVID-19. Concentration d'ADN plasmatique exempt de cellules nucléaires (ncfDNA) (UNE) et cfDNA sans cellules mitochondriales (mtcfDNA) (B) pour les témoins sains (HC, bleu, n = 31), les patients atteints de grippe ou de VRS (rose, n = 21), et les patients COVID-19 (rouge clair, n = 79). (CP) Identification du contributeur cellulaire/tissu du cfDNA en utilisant la déconvolution des signatures de méthylation de l'ADN spécifiques aux tissus sur le cfDNA : (C) monocytes-, () neutrophile-, (E) érythroblaste-, (F) lymphocyte-, (g) cellule endothéliale vasculaire-, (H) adipocyte-, (je) hépatocytes-, (J) pancréas-, (K) vessie-, (L) côlon entérocytes-, (M) un rein-, (N) cœur-, (O) poumon-, et (P) cfDNA dérivé du larynx de la tête et du cou chez les patients atteints de HC, de grippe et de VRS et de patients COVID-19. Graphiques à barres exprimés en moyenne ± SEM. Les niveaux de signification statistique pour chaque comparaison par paires ont été déterminés en utilisant P valeurs calculées selon la procédure de Hommel. Ajusté P les valeurs sont affichées. P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 et ****P < 0.0001.

Nous avons ensuite demandé si le cfDNA (source en vrac ou tissulaire) chez les patients COVID-19 différait des autres infections virales respiratoires (grippe et VRS). Les niveaux médians de ncfDNA et de mtcfDNA étaient 4,7 fois et 67 fois plus élevés chez les patients COVID-19 que chez les patients atteints de grippe et de VRS, respectivement P < 0,0001. (Figure 3, A et B). Pour contrôler la gravité de la maladie, nous avons comparé les patients hospitalisés selon l'échelle de l'OMS. P < 0,0001 pour les deux comparaisons (Figure supplémentaire 1, A et B). De même, le cfDNA tissu-spécifique dérivé des monocytes, des érythroblastes, des lymphocytes, de l'endothélium vasculaire, des adipocytes, des hépatocytes, du pancréas, de la vessie et des poumons était 2 à 11 fois plus élevé chez les patients hospitalisés COVID-19 que chez les patients hospitalisés atteints de grippe et de VRS P < 0,05 pour toutes les comparaisons (Figure supplémentaire 1, C–P).

Le profil cfDNA prédit les résultats des patients COVID-19. Au sein des groupes COVID-19, nous avons observé différentes quantités de cfDNA total, mtcfDNA et cfDNA de différents types de tissus (Figure 2) profils de cfDNA en corrélation avec une mesure simultanée de la gravité de la maladie évaluée par l'échelle de l'OMS. Ensuite, nous avons cherché à déterminer si les mesures cfDNA à l'admission peuvent prédire les résultats ultérieurs des patients, y compris le décès. Seul le premier échantillon par patient a été pris en compte et nous n'avons inclus que les patients qui avaient un premier échantillon prélevé dans les 0 à 2 jours suivant l'admission, choisis arbitrairement pour représenter une admission précoce. Au total, 61 patients répondaient à ces critères d'inclusion, dont 17 patients décédés et 44 patients ayant survécu. Nous avons constaté que les niveaux plasmatiques d'ADNncf dans les 2 premiers jours suivant l'admission à l'hôpital étaient 4,5 fois plus élevés chez les patients qui sont finalement décédés de COVID-19 par rapport aux patients qui se sont rétablis (196 790 contre 43 470 copies/mL, P < 0,0001 Figure 4A). Le niveau d'ADNmtcf ne différait pas significativement chez les patients décédés plus tard par rapport aux patients qui se sont rétablis (P = 0,5291 Figure 4B). Nous avons en outre comparé les profils de lésions tissulaires dans les 2 groupes de patients COVID-19 : ceux qui sont décédés de la maladie par rapport à ceux qui ont survécu. Concentrations moyennes élevées de cfDNA dérivé des monocytes (8 418 contre 4 245 copies/mL), des neutrophiles (106 400 contre 12 920 copies/mL), des érythroblastes (21 660 contre 4 606 copies/mL), de l’endothélium vasculaire (7 141 contre 2 146 copies/mL) ), adipocytes (6 187 vs 1 147 vs copies/mL), hépatocytes (29 300 vs 3 012 copies/mL), pancréas (5 732 vs 857 copies/mL), vessie (1 434 vs 907 copies/mL), cœur ( 2 140 contre 339 copies/mL) et les poumons (2 925 contre 1 040 copies/mL) ont été observés chez les patients décédés par la suite par rapport aux survivants P < 0,05 pour toutes les comparaisons. Bien que non statistiquement significatif, il y avait un niveau plus élevé de cfDNA dérivé de l'intestin, des reins et du larynx de la tête et du cou (Figure 4, C-P).

Niveaux de cfDNA plasmatique par résultat COVID-19. Les patients ont été stratifiés selon les résultats COVID-19 comme non hospitalisés, représentant les patients atteints d'une maladie bénigne qui n'ont pas nécessité d'hospitalisation (non hospitalisés), gris (n = 18) patients hospitalisés qui se sont rétablis (Hosp-R), bleu clair (n = 48) ou hospitalisés décédés (Hosp-D), rouge clair (n = 18). (UNE) cfDNA nucléaire (ncfDNA), (B) cfDNA mitochondrial (mtcfDNA) et cfDNA de différents types de tissus (CP) sont indiqués pour les 3 groupes de patients COVID-19. Seules les mesures cfDNA au début de la maladie COVID-19 ont été prises en compte (le premier échantillon par patient, généralement les jours 0 à 2 de l'admission pour les patients hospitalisés ou proche du test pour les patients atteints de COVID-19 léger). Les types de tissus suivants sont indiqués : (C) monocytes, () les neutrophiles, (E) érythroblastes, (F) lymphocytes, (g) cellules endothéliales vasculaires, (H) les adipocytes, (je) hépatocytes, (J) pancréas, (K) vessie, (L) entérocytes du côlon, (M) un rein, (N) cœur, (O) poumon, et (P) larynx de la tête et du cou. Graphiques à barres exprimés en moyenne ± SEM. Les niveaux de signification statistique pour chaque comparaison par paires ont été déterminés en utilisant P valeurs calculées selon la procédure de Hommel. Ajusté P les valeurs sont affichées. P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives *P < 0.05, **P < 0,01 et ****P < 0.0001.

Nous avons ensuite effectué une analyse multivariée examinant l'association entre le ncfDNA et le résultat (décédé contre rétabli), en corrigeant les covariables cliniques et démographiques. Les variables incluses à des fins de comparaison étaient le sexe, l'âge, l'obésité et la présence d'un cancer. Ces 4 covariables ont atteint le seuil de signification statistique dans l'analyse univariée (tableau 1) pour être incluses dans l'analyse multivariée ultérieure. De plus, ces variables ont été jugées cliniquement pertinentes, de même que l'âge avancé, l'obésité et le sexe masculin étaient tous associés à une trajectoire clinique plus sévère. Après ajustement pour ces covariables, le ncfDNA est resté significativement associé au décès (OR = 13,3, IC à 95 % 2,2–82,1, P = 0,0053 Tableau supplémentaire 2).

Nous avons ensuite évalué la capacité prédictive des profils cfDNA à l'admission du patient en utilisant l'analyse de la courbe caractéristique de fonctionnement (ROC) du récepteur. Le total ncfDNA distinguait les patients qui sont finalement décédés par rapport à ceux qui ont survécu avec une ASC de 0,787 (IC à 95 % = 0,676-0,899, P < 0,0001 Figure 5A), alors que mtcfDNA a montré une capacité de performance non significative (AUC = 0,579 IC à 95 % = 0,420-0,738, P = 0,3426 Figure 5B). Nous avons également observé des performances élevées pour les cfDNA spécifiques aux tissus suivants : monocytes (AUC = 0,768 95% IC = 0,634-0,901), neutrophiles (AUC = 0,847 95% IC = 0,738-0,956), érythroblastes (AUC = 0,813, 95% IC = 0,691-0,936), endothélium vasculaire (ASC = 0,814, IC à 95 % = 0,626-1,000), adipocytes (ASC = 0,789, IC à 95 % = 0,605-0,971), hépatocytes (ASC = 0,815, IC à 95 % = 0,632- 0,997), pancréas (ASC = 0,835, IC à 95 % = 0,741-1,000), vessie (ASC = 0,884, IC à 95 % = 0,748-1,000), cœur (ASC = 0,829, IC à 95 % = 0,688-0,967) et poumon (ASC = 0,847, IC à 95 % = 0,682-1,000) (Figure 5, C-M).

Le profil cfDNA distingue les patients atteints de COVID-19 selon les résultats. Analyse de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) des mesures cfDNA tôt à l'admission en tant que prédicteur et résultats COVID-19 classés comme hospitalisés récupérés et décédés : (UNE) ADNncf, (B) ADNmtcf, (C) cfDNA dérivé de monocytes, () cfDNA dérivé des neutrophiles, (E) cfDNA dérivé d'érythroblastes, (F) cfDNA dérivé de l'endothélium vasculaire, (g) cfDNA dérivé d'adipocyte, (H) cfDNA dérivé des hépatocytes, (je) cfDNA dérivé du pancréas, (J) cfDNA dérivé de la vessie, (K) cfDNA dérivé du rein, (L) cfDNA dérivé du cœur, et (M) cfDNA dérivé du poumon.

Nous avons en outre déterminé les changements longitudinaux du profil cfDNA au cours d'un COVID-19 sévère, en nous concentrant sur les patients de soins intensifs COVID-19 décédés par rapport aux patients de soins intensifs qui ont survécu. Les niveaux de ncfDNA et les niveaux de cfDNA spécifiques aux tissus étaient plus élevés et maintenus chez les patients COVID-19 gravement malades qui sont finalement décédés par rapport à ceux qui se sont rétablis (figure 6).

Cinétique des profils cfDNA pour les patients par résultat COVID-19. Changements dans les mesures de cfDNA spécifiques aux tissus au fil du temps pour les prototypes de patients COVID-19 qui ont eu besoin de soins intensifs et ont récupéré (récupéré) ou sont décédés (décédé) une tendance croissante de cfDNA chez les personnes décédées (UNE) et une tendance à la baisse de cfDNA dans Recovered (Eje). La concentration de cfDNA en copies/mL est représentée dans le oui axe et jours à compter de l'admission à l'hôpital représentés dans le X (jour 0 représentant le jour de l'hospitalisation). cfDNA du type de tissu individuel est montré et une clé de chiffre est représentée.

Le profil cfDNA différencie les patients COVID-19 par trajectoire clinique. Pour évaluer si le niveau de cfDNA distinguait les patients en fonction de leur trajectoire clinique, nous avons classé les patients en fonction de leur échelle OMS maximale au cours de leur maladie en cas légers non hospitalisés (échelle OMS 1, 2), modérés/hospitalisés non en soins intensifs (échelle OMS 3, 4) , et soins intensifs sévères/hospitalisés (échelle OMS 5-8). En analysant le premier échantillon pour chaque patient dans les jours 0 à 2 suivant l'admission, les patients atteints de COVID-19 sévère avaient un ncfDNA élevé à l'admission (152 600 copies/mL) par rapport à une maladie modérée (15 790 copies/mL) et des cas légers (2 750 copies/mL ) P < 0,0001 pour les deux comparaisons (Figure 7A). Les patients atteints de COVID-19 sévère et modéré présentaient des taux d'ADNmtcfD significativement plus élevés que les patients non hospitalisés atteints de COVID-19 léger, P < 0,001. Cependant, les niveaux d'ADNmtcf n'étaient pas significativement différents entre les patients atteints de COVID-19 modéré et sévère (Figure 7B). Plus important encore, les tissus d'origine du cfDNA (copies/mL) différaient : les patients atteints de COVID-19 sévère avaient un niveau accru de ncfDNA (copies/mL) dérivé des monocytes (8 114 contre 3 429), des neutrophiles (74 300 contre 4 142), érythroblastes (17 960 vs 2 521), endothélium vasculaire (5325 vs 375), adipocytes (5 600 vs 1 025), hépatocytes (15 040 vs 746), pancréas (1 925 vs 215), intestin (1 657 vs 35), vessie (1 583 contre 216), rein (2 345 contre 374), cœur (3 609 contre 600), poumon (2 425 contre 94) et tête et cou (1 439 contre 252) par rapport à COVID-19 hospitalisé non en soins intensifs les patients P < 0,05 pour tous. Les patients atteints d'une maladie bénigne présentaient un cfDNA tissu-spécifique significativement plus faible, y compris les monocytes (504 copies/mL), les neutrophiles (1462 copies/mL), les érythroblastes (1335 copies/mL), les lymphocytes (203 copies/mL), l'endothélium vasculaire (74 copies /mL), adipocyte (88 copies/mL), hépatocyte (32 copies/mL), pancréas (3 copies/mL), vessie (9 copies/mL), intestin (12 copies/mL), rein (28 copies/mL ), des poumons (2 copies/mL) et de la tête et du cou (22 copies/mL) par rapport aux cas sévères et modérés, P < 0,05 pour tous. De plus, les patients atteints de COVID-19 léger présentaient des niveaux plus élevés d'ADNmtcf et d'ADN cfd dérivés de monocytes, de neutrophiles, d'érythroblastes, d'hépatocytes, de vessie, de cœur et de poumon que les témoins sains, comme observé chez les patients atteints d'une maladie grave, P < 0,05 Figure 7, C–P.

Niveaux de cfDNA plasmatique pour les patients COVID-19 par gravité. (UNE et B) Comparaison des mesures du cfDNA plasmatique pour les témoins sains (HC) indiquées en bleu clair (n = 31) et les patients COVID-19. Les patients COVID-19 ont été classés en fonction de la gravité maximale de la maladie au cours de leur maladie à l'aide de l'échelle de l'OMS 1-2 représente les patients atteints d'une maladie bénigne ne nécessitant pas d'hospitalisation (légère) indiqués en gris (n = 18), 3 à 4 représentent les patients hospitalisés ne nécessitant pas de soins intensifs (modérés) représentés en rose clair (n = 20), et 5 à 8 représentent les patients hospitalisés nécessitant des soins en unité de soins intensifs (graves) indiqués en rouge clair (n = 30). Seules les mesures de cfDNA au début du cours COVID-19 ont été prises en compte (le premier échantillon par patient, généralement les jours 0 à 2 de l'admission pour les patients hospitalisés ou proche du test pour les patients atteints de COVID-19 léger). CK représentent le cfDNA de différents types de tissus regroupés par catégories de patients : (C) monocytes, () les neutrophiles, (E) érythroblastes, (F) lymphocytes, (g) cellules endothéliales vasculaires, (H) les adipocytes, (je) hépatocytes, (J) pancréas, (K) vessie, (L) entérocytes du côlon, (M) un rein, (N) cœur, (O) poumon, et (P) larynx de la tête et du cou. Graphiques à barres exprimés en moyenne ± SEM. Les niveaux de signification statistique pour chaque comparaison par paires ont été déterminés en utilisant P valeurs calculées selon la procédure de Hommel. Ajusté P les valeurs sont affichées. P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.

Nous avons ensuite testé les performances des profils cfDNA d'admission précoce pour identifier les patients hospitalisés qui ont eu besoin de soins intensifs par rapport aux patients qui n'en ont pas besoin. L'analyse ROC a démontré que le plasma ncfDNA a montré une performance discriminante élevée entre les patients en soins intensifs et les patients hospitalisés non-USI (ASC = 0,917, IC à 95 % = 0,847-0,987, P < 0,0001 Figure 8A), alors que mtcfDNA n'a pas fait la distinction entre les patients COVID-19 en soins intensifs et non-USI.Le profil cfDNA tissu-spécifique a également montré une performance discriminante élevée entre les patients en soins intensifs et non-USI dans le cfDNA dérivé de monocytes (AUC = 0,870 IC à 95 % = 0,765-0,976), les neutrophiles (AUC = 0,967 IC à 95 % = 0,924 à 1,000) , érythroblastes (ASC = 0,869, IC à 95 % = 0,761 à 0,967), endothélium vasculaire (ASC = 0,800, IC à 95 % = 0,631 à 0,696), hépatocytes (ASC = 0,824, IC à 95 % = 0,682 à 0,965), adipocytes (ASC = 0,877, IC à 95 % = 0,771 à 0,982), pancréas (ASC = 0,911, IC à 95 % = 0,793 à 1,000), vessie (ASC = 0,979, IC à 95 % = 0,931 à 1,000), intestin (ASC = 0,958, 95 % IC = 0,866-1,000), rein (ASC = 0,795, IC à 95 % = 0,634-0,959), cœur (ASC = 0,882, IC à 95 % = 0,768-0,997), poumon (ASC = 0,938, IC à 95 % = 0,842-1 000 ), et tête et cou (ASC = 0,881, IC à 95 % = 0,754-1,000) P < 0,01 (Figure 8, B–N). Ensuite, nous avons calculé l'AUC pour les marqueurs inflammatoires traditionnels tels que la protéine C-réactive (CRP), les D-dimères, le rapport neutrophiles/lymphocytes (N/L) et la troponine pour différencier les patients hospitalisés en USI et non USI (Figure supplémentaire 2 ). Nous avons trouvé des performances inférieures par rapport au profil cfDNA, avec une ASC de 0,582 (IC à 95 % = 0,359-0,805 P = 0,4611), 0,689 (IC à 95 % = 0,480-0,894 P = 0,099), 0,764 (IC à 95 % = 0,567-0,959 P = 0,0177) et 0,763 (IC à 95 % = 0,550-0,976 P = 0,0343), respectivement. En outre, nous avons examiné si le profil cfDNA pouvait distinguer les patients hospitalisés qui développent un COVID-19 modéré/sévère des patients non hospitalisés atteints de COVID-19 léger. Nous avons constaté que les niveaux de cfDNA avaient une excellente capacité discriminante, avec une ASC allant de 0,982 à 0,881 (Figure supplémentaire 3, A–P).

Le profil cfDNA distingue les patients selon la gravité du COVID-19. L'analyse de la courbe des caractéristiques de fonctionnement du récepteur (ROC) des mesures du cfDNA au début de l'admission en tant que prédicteur et de la gravité maximale du COVID-19 pendant la maladie en tant que variable de résultat. Analyse ROC montrant la performance des profils cfDNA pour distinguer les patients hospitalisés qui ont ensuite eu besoin de soins intensifs par rapport aux patients hospitalisés qui n'ont pas : (UNE) ncfADN-, (B) monocytes-, (C) neutrophile-, () érythroblaste-, (E) endothélium vasculaire– (F) adipocyte-, (g) hépatocytes-, (H) pancréas, (je) vessie-, (J) intestin-, (K) un rein-, (L) cœur-, (M) poumon-, et (N) cfDNA dérivé du larynx de la tête et du cou.

Corrélation entre les profils cfDNA et les mesures des lésions des organes cibles. Le score maximal de l'OMS est l'une des mesures les plus couramment utilisées pour évaluer le spectre clinique du COVID-19. De manière frappante, nous avons constaté une forte augmentation du niveau de ncfDNA, l'échelle maximale de l'OMS allant de 1 à 8 (figure 9A). Le profil cfDNA tissu-spécifique des neutrophiles, des érythroblastes, de l'endothélium vasculaire, des adipocytes et du poumon a également montré des tendances similaires. Bien qu'une tendance à la hausse n'ait pas été observée dans le cfDNA dérivé des hépatocytes, des reins et du cœur, nous avons trouvé un niveau plus élevé pour un score clinique de l'OMS de 8 par rapport à 7. Le niveau de mtcfDNA et de cfDNA dérivé des monocytes et des lymphocytes n'était pas corrélé avec le score OMS maximum (Figure 9, B–L).

Corrélation du cfDNA avec l'échelle de l'OMS pour la gravité du COVID-19, les marqueurs inflammatoires et les marqueurs de lésion tissulaire. Tendances du profil cfDNA sur l'échelle ordinale de l'OMS 1 à 8 (1, vert clair 3, bleu clair 4, rose clair 5, jaune 7, orange 8, rouge) : (UNE) ADNncf, (B) ADNmtcf, (C) cfDNA dérivé de monocytes, () cfDNA dérivé des neutrophiles, (E) cfDNA dérivé d'érythroblastes, (F) cfDNA dérivé de lymphocytes, (g) cfDNA dérivé de l'endothélium vasculaire, (H) cfDNA dérivé d'adipocyte, (je) cfDNA dérivé des hépatocytes, (J) cfDNA dérivé du rein, (K) cfDNA dérivé du cœur, et (L) cfDNA dérivé du poumon. Corrélation entre (M) ncfDNA et protéine C-réactive (CRP), (N) ncfDNA et D-dimères, (O) ncfDNA et nombre absolu de globules blancs, (P) cfDNA dérivé des neutrophiles et nombre absolu de neutrophiles, (Q) cfDNA dérivé d'hépatocytes et aspartate aminotransférase (AST), (R) cfDNA et troponine d'origine cardiaque, (S) cfDNA et CRP dérivés de neutrophiles, et (T) ncfDNA et D-dimère dérivés des neutrophiles. Le coefficient de corrélation de Spearman a été utilisé pour calculer la signification statistique. P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Nous avons ensuite comparé les profils de cfDNA avec des biomarqueurs connus de lésions des organes cibles ou d'inflammation systémique et avons trouvé une association positive significative entre le ncfDNA et la CRP (ρ = 0,558, P < 0,0001), D-dimères (ρ = 0,536, P < 0,0001), et le nombre de globules blancs (ρ = 0,504, P = 0,0001). De plus, le cfDNA dérivé des cellules et des tissus était associé à des lésions organiques : le cfDNA dérivé des neutrophiles et le nombre absolu de neutrophiles (ρ = 0,543, P < 0,0001), cfDNA hépatocytaire et aspartate transaminase (ρ = 0,534, P < 0,0027), le cfDNA dérivé des myocytes cardiaques et la troponine (ρ = 0,461, P < 0,027) (Figure 9, M–P). Fait intéressant, le cfDNA dérivé des neutrophiles était également positivement corrélé avec la CRP et les D-dimères (ρ = 0,41, P < 0,0028 et = 0,45, P < 0,0008, respectivement Figure 9, Q–T). Ainsi, le cfDNA spécifique aux tissus était en corrélation avec les mesures traditionnelles de l'inflammation et des lésions organiques.

Le plasma COVID-19 induit la production de superoxyde mitochondrial dans les cellules tubulaires rénales. Dans un modèle AKI de septicémie chez la souris, nous avons précédemment montré que le cfDNA circulant, un DAMP, augmentait la production de superoxyde mitochondrial (mtROS) via une réponse inflammatoire dépendante de TLR9 (30). Ainsi, nous avons évalué si le plasma du patient COVID-19 contenait également des DAMP qui induisent un excès de mtROS (fluorescence rouge MitoSOX mesurée par microscopie confocale) dans les cellules tubulaires proximales primaires de souris (mPPTC). Pour éviter l'activation du complément ou les dommages oxydatifs causés par les débris cellulaires, le plasma a été inactivé à la chaleur et centrifugé avant d'être ajouté aux cellules.

Nous avons appliqué 1 %, 3 % ou 10 % de plasma du patient COVID-19 A (figure 10A) sur des mPPTC, puis capturé des images longitudinales à 0, 3, 12 et 24 heures (figure 10B). Le plasma du jour 1 et du jour 8 a augmenté le superoxyde d'une manière dépendante de la dose et du temps par rapport au plasma non traité ou à 3 % d'un volontaire sain (Figure 10, E et F). De plus, le plasma du jour 8 a augmenté l'intensité de MitoSOX Red plus que le plasma du jour 1 (Figure 10, C et D), le plasma du jour 8 a montré une cfDNA plus élevée que le plasma du jour 1. Des résultats similaires ont été observés chez le patient B (Figure supplémentaire 4).

Génération dépendante du temps et de la concentration de ROS mitochondriales. La culture cellulaire de cellules tubulaires proximales primaires de souris (mPPTC) a été traitée avec du plasma de patient COVID-19 en série. (UNE) dynamique mtcfDNA et ncfDNA du plasma du patient COVID-19 A au jour 1 et au jour 8 après l'admission. Le plasma du jour 8 contenait plus de ncfDNA et de mtcfDNA que le jour 1. (B) Images représentatives du superoxyde mitochondrial dans les mPPTC traités avec contrôle (pas de traitement), 3% de plasma de volontaires sains, 1% et 3% de plasma du patient A COVID-19 du jour 8 après 3 et 12 heures d'incubation : a. Contrôle (pas de traitement) à 24 heures b. 24 heures après l'ajout de plasma de volontaires sains (3 %) c. 3 heures après l'ajout du plasma du patient A COVID-19 au jour 8 (1%) d. 3 heures après l'ajout du plasma du patient A COVID-19 au jour 8 (3 %) e. 12 heures après l'ajout du plasma du patient A COVID-19 au jour 8 (1%) f. 12 heures après l'ajout du plasma du patient A COVID-19 au jour 8 (3%). Rouge : MitoSOX Rouge représentant le superoxyde mitochondrial, bleu : Hoechst3342 représentant les noyaux. Grossissement d'origine : ×400. (C et ) Comparaison de l'intensité du MitoSOX Red dans les mPPTC (n = 18 à 29 cellules de 3 à 5 champs/groupe) avec (C) 1% et () 3% de plasma du patient COVID-19 en série A et après 0, 3, 12 et 24 heures d'incubation. Chaque point représente l'intensité totale corrigée du bruit de fond MitoSOX Red pour 1 cellule tubulaire. La barre dans les nuages ​​de points est exprimée en moyenne ± SEM. La signification statistique a été déterminée à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis et d'un test post hoc de Mann-Whitney. P valeur inférieure à 0,05 considérée comme statistiquement significative *P < 0,05 : jour 1 versus jour 8. (EF) Le temps d'incubation (0, 3, 12 et 24 heures) et la dose plasmatique (0,3 %, 1 %, 3 % et 10 %) dépendent de l'intensité de MitoSOX Red dans les mPPTC (n = 18 à 29 cellules/3 à 5 champs/groupe). Le graphique à barres 3D est exprimé en moyenne. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test de comparaison multiple de Tukey après ANOVA à deux facteurs. *P < 0,05 par rapport au témoin, #P < 0,05 versus 3% plasma sain,P < 0,05 versus 0 heure d'incubation.

Le cfDNA de COVID-19 induit la production de mtROS, qui est atténuée par l'inhibition de TLR9. Ensuite, nous avons évalué si le cfDNA contenu dans le plasma COVID-19 pouvait générer du mtROS dans les mPPTC. Nous avons purifié le cfDNA du plasma du patient COVID-19, puis ajouté une quantité de cfDNA équivalente à 3 % de plasma dans les mPPTC. Nous avons testé le plasma collecté en série du patient COVID-19 B parce que le rapport de ncfDNA à mtcfDNA a considérablement changé au fil du temps (jour 1 : mtcfDNA-rich/ncfDNA-pauvre cfDNA jour 7 : mtDNA- et nDNA-pauvre cfDNA jour 9 : mtcfDNA-pauvre cfDNA riche en /ncfDNA) (Figure 11A). Fait intéressant, le plasma du jour 1 et du jour 9 a augmenté la fluorescence MitoSOX Red, mais le plasma du jour 7 n'a pas augmenté la fluorescence MitoSOX Red, par rapport au plasma témoin sain (figure 11B). Le cfDNA purifié du plasma du jour 1 (riche en mtcfDNA) et du jour 9 (riche en ncfDNA) a augmenté le superoxyde par rapport au jour 7 du cfDNA (ADNmt et ADNn tous deux faibles) et du tampon d'ADN témoin (figure 11C). Lorsque le cfDNA purifié a été comparé à un volume équivalent de plasma, il n'y avait aucune différence dans la production de superoxyde aux jours 1, 7 et 9 (figure 11D).

Stimulation cfDNA plasmatique purifiée de la production de mtROS et effet de l'inhibition de TLR9. La culture mPPTC a été traitée avec du plasma du patient COVID-19 B ou du cfDNA purifié à partir des mêmes échantillons de plasma. (UNE) dynamique mtcfDNA et ncfDNA dans le plasma du patient COVID-19 B. (B) mPPTC (n = 15 à 44 cellules de 3 à 5 champs/groupe) traitées avec 3 % de plasma sain ou 3 % de plasma de patient B COVID-19 en série et (C) avec un tampon d'ADN de contrôle et une quantité équivalente de cfDNA purifié à partir de plasma COVID-19 en série du patient B MitoSOX Red Intensité mesurée après 6 heures d'incubation. Données résumées comme dans la figure 9. Signification statistique déterminée à l'aide du test de comparaison multiple de Dunnett après le test de Kruskal-Wallis. *P < 0,05 par rapport au témoin, #P < 0,05 par rapport au jour 7. () Comparaison de l'intensité MitoSOX Red avec le plasma du patient B COVID-19 en série (rouge) et le cfDNA purifié à partir du plasma du patient B COVID-19 (violet) après 6 heures d'incubation. Chaque point représente l'intensité totale corrigée du bruit de fond MitoSOX Red pour 1 cellule tubulaire. Graphique linéaire exprimé en moyenne ± SEM. Données analysées à l'aide du test de Mann-Whitney après le test de Kruskal-Wallis. (E) Intensité du rouge MitoSOX dans les mPPTC (n = 26 à 47 cellules de 3 à 6 champs/groupe) traitées avec 3% de plasma sain 3% de plasma de patient COVID-19 avec 10 M d'oligodésoxynucléotide de contrôle (ODN) ou 0, 0,1, 1 ou 10 M d'antagoniste TLR9 (ODN2088) après 6 heures d'incubation. Signification statistique déterminée à l'aide du test de comparaison multiple de Dunnett après le test de Kruskal-Wallis. *P < 0,05 versus 3% de plasma sain, #P < 0,05 versus pas d'ODN, †P < 0,05 versus 10 M d'ODN de contrôle. (F) Comparaison de l'intensité du MitoSOX Red dans les mPPTC (n = 17 à 63 cellules de 3 à 6 champs/groupe) traitées avec du plasma COVID-19 en série ou du plasma COVID-19 avec ODN2088, ou (g) cfDNA en série purifié à partir du plasma du patient B COVID-19 avec et sans ODN2088 après 6 heures d'incubation. Signification statistique déterminée à l'aide d'un test de Mann-Whitney après le test de Kruskal-Wallis. *P < 0,05. Production de mtROS du patient B illustrée dans la figure 4 supplémentaire.

Ensuite, nous avons testé si un antagoniste spécifique de TLR9 pouvait inhiber la surproduction de mtROS induite par le plasma COVID-19 ou le cfDNA purifié (contrôle positif). L'oligonucléotide CpG (CpG-ODN) est un ligand du TLR9 et l'ODN2088 est un antagoniste spécifique du TLR9 de souris qui inhibe l'effet stimulateur des ODN CpG. Tout d'abord, nous avons testé la capacité d'augmenter les concentrations d'ODN2088 à inhiber l'effet de 3% de plasma de patient COVID-19 sur la fluorescence MitoSOX Red. À chaque concentration testée, l'ODN2088 a inhibé l'augmentation plasmatique du COVID-19 de la fluorescence MitoSOX Red par rapport aux témoins (figure 11E). 10 M d'ODN2088 étaient plus efficaces que 1 M d'ODN2088. Ensuite, nous avons évalué l'effet inhibiteur de l'ODN2088 sur la génération de mtROS par cfDNA purifié à partir du patient COVID-19 B. Nous avons trouvé 10 M d'ODN inhibé MitoSOX Red fluorescence générée par le cfDNA du jour 1 et du jour 9 (Figure 11G) dans la même mesure que le jour 1 et plasma du jour 9 (Figure 11F). Nous concluons que la plupart de l'effet du plasma COVID sur la production de superoxyde nécessite une activité cfDNA via le récepteur TLR9. Cependant, nous ne pouvons pas exclure si d'autres médiateurs sont également impliqués, étant donné que l'ODN 2088 peut affecter d'autres voies (36).

Cette étude étend l'utilisation du cfDNA d'être un biomarqueur de diagnostic potentiel qui cartographie les sources de lésions tissulaires à un biomarqueur pronostique qui prédit la trajectoire et les résultats du COVID-19 et à fournir des informations mécanistes sur les lésions tissulaires induites par COVID-19. Nous avons trouvé des niveaux nettement élevés de cfDNA plasmatique total (en vrac) chez les patients atteints de COVID-19, y compris des cfDNA d'origine nucléaire et mitochondriale provenant principalement de cellules hématopoïétiques. Notamment, les profils cfDNA chez les patients infectés par d'autres virus respiratoires, la grippe et le VRS, étaient significativement plus faibles et d'origine divergente de ceux des patients atteints de COVID19. Les patients atteints de COVID-19 ont également montré des sources tissulaires divergentes de cfDNA dès les premiers jours d'admission, y compris le cfDNA des neutrophiles, des adipocytes, des myocytes cardiaques et des cellules endothéliales vasculaires. Les marqueurs cfDNA spécifiques aux tissus étaient en corrélation avec les mesures biochimiques connues des lésions des organes cibles. Certains de ces marqueurs cfDNA spécifiques aux tissus ont démontré des performances élevées pour identifier les patients qui ont nécessité des soins en soins intensifs ou qui sont décédés par la suite, à l'instar des conclusions d'un rapport récent (37). Après une analyse multivariée corrigeant les facteurs de risque connus de la maladie COVID-19 sévère, y compris l'augmentation de l'âge, du sexe masculin et de l'obésité, il restait une association significative de risque élevé de mauvais résultats cliniques. Le cfDNA isolé, qui contient à la fois du cfDNA et du mtcfDNA, a orchestré une stimulation dépendante de TLR9 des ROS mitochondriales qui peut mettre en place un cercle vicieux de lésion tissulaire.

Cet algorithme de déconvolution de méthylation a capturé le cfDNA de plusieurs types de tissus et a montré une source tissulaire de cfDNA divergente chez les patients COVID-19 par rapport aux témoins sains ou à certains virus respiratoires courants tels que la grippe et le VRS. Après avoir comparé la gravité de la maladie, les patients COVID-19 ont montré un ADNncf plus élevé, ainsi qu'un ADN cfd provenant des adipocytes, des cellules endothéliales vasculaires, du pancréas, des myocytes cardiaques et du rein par rapport aux patients atteints de grippe et de VRS. Chez les patients COVID-19, cette approche a montré différentes sources tissulaires de cfDNA, représentant différents modèles de lésions tissulaires. Ces résultats indiquent que l'infection au COVID-19 orchestre des lésions tissulaires étendues, avec une prédilection pour certains types de tissus, comme cela a été directement démontré dans les études d'autopsie (lésions alvéolaires, coagulopathie, lésions rénales et lésions cardiaques) (6, 38 – 40). Cette approche cfDNA est potentiellement informative pour cataloguer les sources tissulaires de blessures et de dysfonctionnement d'organes pour toute affection inconnue, y compris les nouvelles souches de SRAS-CoV-2, les affections auto-immunes inconnues ou d'autres maladies.

Les profils cfDNA chez les patients atteints de COVID-19 étaient corrélés à la gravité de la maladie, évalués par l'échelle ordinale de l'OMS, une échelle de 1 à 8 couramment utilisée pour stratifier les patients selon la gravité de COVID-19. Fait intéressant, les mesures de cfDNA à l'admission étaient corrélées à la trajectoire de la maladie ultérieure mesurée comme l'échelle maximale de l'OMS pendant la maladie COVID-19 des patients. Des résultats similaires ont été rapportés pour mtcfDNA (41). Par exemple, dès les jours 0 à 2 de l'admission, les niveaux de cfDNA pourraient être utilisés pour identifier les patients ayant besoin de soins en soins intensifs (échelle OMS 5 à 8) ou décédés (échelle OMS 8) au cours de leur maladie. De même, les patients hospitalisés ne nécessitant pas de soins en USI (échelle OMS 3-4) ont montré des profils de cfDNA plus élevés que les patients atteints de COVID-19 léger ne nécessitant pas d'hospitalisation (échelle OMS 1-2). Fait intéressant, certains marqueurs cfDNA spécifiques aux tissus tels que le cfDNA cardiaque n'ont augmenté que chez les patients atteints de COVID-19 avec le score le plus élevé sur l'échelle de l'OMS. Une étude précédente a confirmé que le ncfDNA, mais pas le mtcfDNA, contribuait directement à la mort cellulaire et prédisait les trajectoires cliniques dans le cadre d'un traumatisme grave (42). Le rapport neutrophiles/lymphocytes et les marqueurs inflammatoires systémiques comme la CRP ont été utilisés comme prédicteur précoce de la gravité du COVID-19 (43, 44). Nos résultats indiquent que les profils cfDNA à l'admission peuvent faire la distinction entre les patients atteints de COVID-19 à risque de maladie grave et de décès avec de meilleures performances que les marqueurs inflammatoires précédemment rapportés.

Les mesures du cfDNA sont corrélées avec des biomarqueurs connus de maladies graves ou de lésions tissulaires. Par exemple, le nombre absolu de neutrophiles était fortement corrélé avec le cfDNA dérivé des neutrophiles. Nous avons également montré une forte corrélation positive entre les biomarqueurs inflammatoires tels que la CRP et les D-dimères et le ncfDNA total et le cfDNA dérivé des neutrophiles. Cela suggère que les neutrophiles pourraient être impliqués dans l'aggravation de l'inflammation et est cohérent avec les études qui montrent une augmentation de la CRP en phase aiguë non spécifique et des biomarqueurs inflammatoires D-dimères dans COVID-19, en particulier chez les patients qui ont par la suite de mauvais résultats (45, 46). Enfin, le cfDNA spécifique aux tissus était en corrélation avec les marqueurs biochimiques des lésions tissulaires, par exemple, le cfDNA spécifique des myocytes cardiaques au cfDNA spécifique à la troponine ou aux hépatocytes et aux marqueurs de la fonction hépatique tels que l'aspartate transaminase.

Les cellules hématopoïétiques restent un contributeur majeur, contribuant à une plus grande fraction de cfDNA chez les patients COVID-19 que chez les témoins sains, en particulier le cfDNA dérivé des neutrophiles. Fait intéressant, les neutrophiles ont été le principal contributeur à un niveau élevé de cfDNA chez les patients COVID-19, en particulier chez les patients qui ont nécessité des soins en soins intensifs ou qui sont décédés par la suite. Bien que les neutrophiles soient principalement impliqués dans la défense antivirale précoce (47), ils peuvent aggraver l'inflammation pulmonaire. En effet, des études récentes ont signalé une infiltration de neutrophiles dans les poumons (48) et la génération de TNE, qui favorisent ensuite une inflammation excessive et une thrombose intravasculaire qui entraînent des lésions de plusieurs tissus/organes en cas de COVID-19 sévère (49, 50). Les patients atteints de COVID-19 présentaient également des aberrations dans l'érythropoïèse, avec une augmentation des globules rouges nucléés dans la circulation (51). Nous avons trouvé des précurseurs érythroïdes comme le deuxième contributeur le plus prédominant d'origine hématopoïétique, suggérant une augmentation du renouvellement des érythroblastes.Les types de tissus non hématopoïétiques ont également libéré du cfDNA à des niveaux significativement plus élevés que chez les témoins sains. Parmi les tissus non hématopoïétiques, nous avons détecté une augmentation significative du cfDNA dérivé de l'endothélium vasculaire, des adipocytes, du foie, du pancréas, de l'intestin, de la vessie, des reins, du cœur et des poumons chez les patients COVID-19 par rapport aux témoins sains. Ces résultats sont cohérents avec les présentations cliniques des patients atteints de COVID-19 (52 - 55) et reflètent l'implication de plusieurs cellules/tissus/organes dans la pathogenèse de COVID-19.

Des niveaux élevés de cfDNA circulant libérés par les tissus blessés ont été associés à de moins bons résultats cliniques dans de nombreux contextes, notamment les traumatismes (42), la septicémie (56), l'auto-immunité (57) et la transplantation (12). En plus d'être un biomarqueur utile, le cfDNA pourrait jouer un rôle pathogène. Les cfDNA sont des DAMP qui déclenchent une inflammation (58), ajoutant ainsi un mécanisme supplémentaire de lésion tissulaire. Ici, nous avons constaté que l'excès de ncfDNA et de mtcfDNA dans le plasma COVID-19 provoquait la surproduction de mtROS dans les cellules des tubules rénaux via TLR9, ce qui pourrait contribuer à une boucle de rétroaction positive qui contribue à la pathogenèse de la défaillance multiviscérale de COVID-19, c'est-à-dire une lésion tissulaire entraîne la libération de cfDNA, qui agit ensuite sur d'autres types de tissus via TLR9 pour déclencher une lésion tissulaire supplémentaire. Comme pour ces études, nous ne pouvons pas distinguer entre ncfDNA et mtcfDNA sans purification supplémentaire. En raison de la nature peu claire des sites de liaison de TLR9, il n'est pas non plus clair si le nombre de copies ou la masse est plus pertinent, ce qui rend les comparaisons directes entre mtcfDNA et ncfDNA difficiles.

L'IRA se développe chez 20% à 33% des patients atteints de COVID-19 (59, 60), généralement chez les patients présentant une infection plus sévère, et laisse présager un taux de mortalité plus élevé (61). La lésion tubulaire aiguë est une constatation pathologique courante dans l'IRA induite par COVID-19 et l'IRA septique polymicrobienne (62). TLR9 active une réponse immunitaire innée pour produire des cytokines pro-inflammatoires via une voie dépendante de MyD88 (63, 64). Au cours de la septicémie polymicrobienne, mtcfDNA active TLR9 et contribue à la production de cytokines, à l'apoptose splénique et aux lésions tubulaires avec surproduction de mtROS (30). L'inhibition de TLR9 ou MyD88 atténue l'IRA septique et améliore la survie (30, 65, 66).

Bien que le cfDNA soit un biomarqueur prometteur, le cfDNA présente une limitation de la variabilité intra- et interindividuelle, d'un jour à l'autre et en quelques jours, ainsi, la cinétique du cfDNA et l'intervalle de référence doivent être bien évalués (67). L'algorithme de déconvolution comprend les signatures de méthylation de l'ADN de la cellule prédominante dans chaque type de tissu, par exemple, le cfDNA des myocytes cardiaques du cœur ou le cfDNA des hépatocytes du foie. En tant que tel, l'algorithme ne capture pas le cfDNA à partir de types cellulaires de tissus moins prédominants, ce qui peut également montrer une pertinence clinique. De plus, l'algorithme de déconvolution capture le cfDNA à partir d'un large éventail, mais pas de tous les types de tissus. Néanmoins, nous avons montré que les profils cfDNA capturés étaient cliniquement pertinents. Les limitations supplémentaires de cette étude incluent les données cliniques et les mesures de laboratoire manquantes pour certains patients et le manque d'échantillonnage de plasma en série chez un petit nombre de participants à l'étude. De futures études sont nécessaires pour valider ces résultats dans une cohorte plus large en disséquant des phénotypes cliniques pour tester l'applicabilité de la technologie et étudier le rôle du cfDNA en tant que déclencheur de lésions tissulaires dans d'autres organes.

Pris ensemble, ces résultats ont démontré que le cfDNA plasmatique fournit un profil complet des lésions tissulaires chez les patients atteints de COVID-19. Les niveaux (à la fois plasmatiques en vrac et spécifiques aux tissus) fournissent des biomarqueurs pronostiques utiles pour la trajectoire et la morbidité des patients. Ces marqueurs peuvent être utiles pour identifier les patients à haut risque au début de la COVID-19 afin d'initier un traitement utile. Le cfDNA est également un DAMP, ce qui entraîne une surproduction de ROS, ce qui provoque une inflammation excessive et des dommages collatéraux aux tissus. S'il est validé, le cfDNA sera utilisé comme un outil clinique non invasif, et l'inhibition de la signalisation mtROS et/ou TLR9 sont des cibles thérapeutiques potentielles.

Conception de l'étude, cadre et participants. Nous avons mené une étude de cohorte prospective à l'hôpital Johns Hopkins, au centre médical de l'Université du Maryland et à l'hôpital Inova Fairfax du 21 avril 2020 au 30 septembre 2020. Dans chaque établissement, les patients diagnostiqués avec COVID-19 par un SRAS-CoV-2 positif Les tests d'ARN ont été inscrits dans un protocole conçu pour générer un référentiel de biospécimens lié aux données cliniques pour l'investigation. Les participants identifiés comme positifs pour le SARS-CoV-2 PCR ont consenti à participer à l'étude et à ce que les informations cliniques soient liées à leur numéro d'identification de sujet d'étude. Des échantillons, y compris du sang à transformer en sérum, plasma et PBMC, ont été obtenus le plus près de l'heure d'admission (jour 0), quelques fois par semaine par la suite, et chaque semaine après le jour 7 jusqu'à la sortie pour les patients hospitalisés. Pour les patients COVID-19 non hospitalisés, un seul échantillon temporel a été collecté près du jour de leur test positif. Les informations démographiques, les résultats des tests de laboratoire clinique, les diagnostics codés par la CIM-10 enregistrés dans les dossiers des patients (comorbidités), les listes de médicaments, l'indice de masse corporelle et d'autres paramètres cliniques ont été liés aux données de tous les participants à l'étude. L'étude a également collecté du plasma de 32 témoins sains et de 21 patients testés positifs pour la grippe et/ou le VRS pour servir de groupe de comparaison. Des échantillons de patients atteints de grippe et/ou de VRS ont été collectés le jour de leur test positif, c'est-à-dire lors de l'admission pour les patients hospitalisés ou lors des visites à la clinique pour les patients non hospitalisés. Les données démographiques, les caractéristiques cliniques, les données sur l'utilisation des soins de santé et l'évaluation en laboratoire des lésions des organes cibles ont été recueillies. La mesure de l'échelle ordinale à 8 points de l'OMS pour l'amélioration clinique, qui est basée sur l'utilisation des ressources de soins de santé et le décès (35), a été utilisée pour stratifier les patients atteints de COVID-19 par gravité de la maladie en 3 groupes : 1) Cas bénins non hospitalisés (échelle OMS 1 , 2), 2) cas modérés hospitalisés non en USI (échelle OMS 3, 4) et 3) cas sévères hospitalisés en USI (échelle OMS 5-8). La sélection et l'expérience des participants à l'étude sont résumées dans la figure 1. Les analyses primaires ont évalué si les paramètres cfDNA mesurés au début de l'évolution de la maladie (admission du patient/test) pouvaient identifier les patients hospitalisés décédés ou nécessitant des soins en soins intensifs le jour 0 à 2 de l'admission ou un test positif. résultat ont été choisis arbitrairement pour représenter la maladie COVID-19 précoce. Nous avons également comparé le cfDNA total et les mesures de cfDNA spécifiques aux tissus entre les groupes pour identifier les différences dans les tendances du cfDNA. Les participants ont également été stratifiés en fonction de leur score OMS maximum pour évaluer les mesures du cfDNA par rapport au besoin d'USI (échelle OMS 3-4 contre 5-8) ou de décès (échelle OMS 3-7 contre 8).

Collecte d'échantillons de plasma. Le sang total a été prélevé dans un tube de prélèvement sanguin cfDNA (Streck), centrifugé à 1600g pendant 10 minutes à 4°C pour séparer le plasma, et conservé immédiatement à –80°C. Dans 2 centres, le sang total a été collecté dans des tubes EDTA et centrifugé dans les 1 à 2 heures avant qu'une lyse cellulaire significative ne se produise et stocké à -80˚C jusqu'à son utilisation. Pour l'isolement du cfDNA, 1 ml de plasma a été utilisé comme matériau de départ. L'échantillon a été centrifugé à 4°C à 16 000g pendant 5 minutes pour éliminer les débris résiduels et additionné de 0,142 ng d'ADN lambda non méthylé fragmenté de 170 pb (Promega, D1521) pour mesurer l'efficacité d'extraction et l'efficacité de conversion du bisulfite. Les échantillons de plasma ont été dilués avec 1 ml de PBS avant l'isolement du cfDNA par le kit d'ADN circulant QIAsymphony en utilisant un protocole personnalisé de 2 ml. Le cfDNA a été élué dans 60 L de tampon Tris-EDTA (TE) à faible teneur en EDTA.

quantification cfDNA. Le cfDNA isolé a été quantifié en mesurant les copies de ncfDNA et de mtcfDNA avec des tests de détermination du nombre de copies par PCR numérique (ddPCR) (ID de test Bio-Rad : dHsaCP2500316 et dHsaCNS669425578) sur un système ddPCR QX200. Un test est ciblé sur le facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2C1 (EIF2C1) pour la quantification du ncfDNA et un autre est ciblé sur la NADH déshydrogénase 1 (ND1) pour le mtcfDNA. En bref, un volume total de 22 L de mélange réactionnel ddPCR contenant 11 L de Supermix ddPCR 2 × pour sondes (sans dUTP), 4 L d'ADN matrice (dilué 10 à 100 fois) et 0,55 μL de chaque test ddPCR 20 × et 4,8 L d'eau sans nucléase ont été répartis en environ 17 000 gouttelettes sur le générateur de gouttelettes automatisé Bio-Rad, en triple. La plage de gouttelettes était de 13 200 à 22 500 dans nos expériences, ce qui était supérieur à la limite du fabricant de 10 000 gouttelettes par échantillon. Les gouttelettes générées ont été amplifiées avec les conditions thermiques suivantes : 95°C pendant 10 minutes, suivi de 40 cycles de 15 secondes à 95°C et 1 minute à 60°C avec une vitesse de rampe réglée à 2,5°C/s. Enfin, les gouttelettes ont été lues sur un lecteur de gouttelettes Q×200 et les données ont été analysées à l'aide du logiciel QuantaSoft.

Les fragments d'ADN lambda enrichis ont été quantifiés par qPCR. En bref, un mélange PCR de 10 L contenant 2 L de matrice cfDNA (1:10 dilué), 5 L de SYBR Green Supermix (Bio-Rad), 2 L d'eau sans nucléase et 1 L de paire d'amorces ont été préparés en triple. Le mélange réactionnel a été passé sur un cycleur QuantStudio 3 qPCR (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific), avec une dénaturation initiale de 95°C pendant 5 minutes suivie de 35 cycles de 95°C pendant 15 secondes et un annelage à 60°C pendant 1 minute . Les concentrations ont été calculées à l'aide d'une courbe standard générée à partir d'ADN lambda dilué en série 10 fois (1,1 ng à 1,1 × 10–5 ng) (Promega). Les séquences d'amorces étaient les suivantes : sens direct, 5'-GACCTCTATGCCAACACAGT-3' et inverse, 5'-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'. L'efficacité d'extraction a été calculée en divisant l'ADN lambda détecté en qPCR par la concentration originale d'ADN lambda dopé dans le plasma.

Traitement au bisulfite, construction de bibliothèques, validation et séquençage. La qualité du cfDNA extrait a été analysée par analyse cfDNA ScreenTape sur le système TapeStation 4150 (Agilent Technologies) avant la conversion au bisulfite. Le cfDNA a ensuite été traité avec le kit EZ DNA methylation-gold (Zymo Research) selon la recommandation du fabricant pour convertir les résidus de cytosine non méthylés en uracile. La bibliothèque d'ADN methyl-Seq a été préparée à l'aide du kit Accel-NGS Methyl-Seq DNA Library avec Unique Dual Indexing (Swift Biosciences) pour le séquençage du génome entier au bisulfite. La qualité de la banque d'ADN construite a été évaluée à l'aide d'un ScreenTape D1000 haute sensibilité et quantifiée par le kit de dosage Quant-iT PicoGreen dsDNA (Life Technologies). Les banques d'ADN ont ensuite été regroupées en concentrations équimolaires et soumises à un séquençage d'ADN à extrémités appariées de 2 × 100 pb sur la plate-forme Illumina NovaSeq 6000.

Analyse bioinformatique. Les lectures de séquences ont été analysées comme suit : contrôle qualité, rognage et mappage à la séquence de référence humaine (assemblage hg38) avec FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), TrimGalore (http : //www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) ( 68 ) et Bismark ( 69 ), respectivement 10 pb ont été coupés des deux extrémités de read1 et read2, en conservant les lectures appariées avec une longueur minimale de L'élimination des doublons par PCR de 50 pb et le contrôle qualité post-alignement ont également été effectués à l'aide de Bismark. La routine d'extraction de méthylation Bismark détermine les états de méthylation de la cytosine et extrait tous les CpG dans des échantillons individuels. Le flux de travail analytique personnalisé utilise ensuite une collection d'outils de bsseq (70) pour analyser et visualiser les données cf-methylome.

Nous avons utilisé l'algorithme meth_atlas (15) pour identifier le tissu ou le type cellulaire d'origine du cfDNA et déconvolution du cfDNA méthylome par échantillon. Meth_atlas utilise un atlas de méthylation de référence de 25 tissus humains et types de cellules pour déterminer les origines tissulaires du cfDNA. Il couvre les principaux organes et cellules impliqués dans les maladies courantes. En utilisant des simulations in silico ainsi que des mélanges in vitro d'ADN provenant de différentes sources tissulaires à des proportions connues, il a été démontré qu'il identifie efficacement le tissu d'origine cfDNA en utilisant un petit nombre de loci (

4 000 CpG réf. 15). Il se rapproche du profil de méthylation du cfDNA plasmatique en tant que combinaison linéaire des profils de méthylation des types cellulaires de l'atlas de référence. Pour obtenir les concentrations de cfDNA dans le tissu ou le type cellulaire d'origine, les proportions relatives estimées de cfDNA ont été multipliées par la concentration totale (ou copies par ml) de cfDNA dans le plasma et ajustées avec l'efficacité d'extraction. La somme des cfDNA individuels des types de tissus individuels doit être égale au ncfDNA total. Cependant, nous n'avons représenté que les sources tissulaires les plus prédominantes de cfDNA. Nous avons utilisé des CpG avec une couverture d'au moins 5 × par échantillon pour l'analyse de déconvolution et l'analyse a été réalisée à l'aide du logiciel R version 3.6.3. Les scripts de l'algorithme de déconvolution se trouvent sur https://github.com/nloyfer/meth_atlas et les scripts d'analyse de la méthylation se trouvent sur https://github.com/seifudd/cfMethylome

Préparation cellulaire. Les mPPTC ont été préparés à partir de souris CD-1 comme indiqué précédemment (71). En bref, les reins ont été récoltés, décapsulés, coupés en petits morceaux avec des instruments stériles et digérés dans de la collagénase tissulaire de type I (30 mg/g MilliporeSigma) pendant 30 minutes à 37°C. Le matériau a été poussé à travers un tamis de 70 um (BD Biosciences), lavé et dilué dans 2 ml de PBS. Les segments tubulaires ont été séparés par centrifugation à 31 % Percoll (GE Healthcare) à 800 g pendant 10 minutes à 4°C. Le culot a été récupéré et lavé deux fois avec du PBS à 370 g pendant 5 minutes à 4°C. Les mPPTC isolés ont été cultivés dans des conditions stériles à 37°C et 5% de CO2 dans un milieu de croissance de cellules épithéliales rénales conditionné 2 (PromoCell). Il a été rapporté que les mPPTC isolés par cette méthode étaient principalement des cellules épithéliales des tubules proximaux (72).

Imagerie de cellules vivantes de mtROS. Les mPPTC ont été étalés sur une lamelle de verre de protection chambrée (Cellvis), incubés avec un milieu optimisé pendant 18 à 24 heures, colorés avec 200 nM de MitoSOX Red et 2 g/mL Hoechst 33343 (Thermo Fisher Scientific) pendant 30 minutes à 37°C, lavés avec HBSS avec Ca et Mg, puis incubé avec ProLong Live Antifade Reagent (Thermo Fisher Scientific). Le plasma du patient COVID-19 a été chauffé à 56°C pendant 30 minutes pour inactiver le complément, puis centrifugé à 16 000g, 4°C pendant 10 minutes. Du plasma de patients COVID-19, ou la quantité équivalente de cfDNA purifié à partir du plasma, a été ajouté à la chambre. Certaines chambres ont été traitées avec un antagoniste spécifique du TLR9 (ODN2088) ou un contrôle négatif pour l'ODN2088 (contrôle ODN2088 InvivoGen). Les images ont été acquises en plusieurs points jusqu'à 24 heures après l'incubation par microscopie confocale équipée d'un système d'incubation environnemental (Zeiss LSM780). Les fluorescences MitoSOX Red et Hoechst 33343 ont été imagées à une excitation de 488 nm et 405 nm et en utilisant des plages d'émission de 562 à 666 nm et 413 à 490 nm, respectivement. Tous les paramètres/réglages d'imagerie sont restés les mêmes pour toutes les acquisitions de données à l'aide du logiciel Zen Zeiss. La fluorescence relative du MitoSOX Red dans les cellules individuelles a été quantifiée à l'aide du logiciel Fidji ou ImageJ (NIH) et ajustée pour la fluorescence de fond. Les intensités de fluorescence ont été transformées en log pour obtenir une distribution plus approximativement normale, mais tous les groupes n'ont pas réussi chaque test de normalité et, par conséquent, des tests post hoc non paramétriques ont été utilisés.

Statistiques. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM pour les variables continues, sauf indication contraire, et de fréquence (pourcentage) pour les variables catégorielles. La différence statistique entre les groupes a été calculée à l'aide d'un modèle de Student non apparié t tester les comparaisons par paires en supposant des variances inégales (c'est-à-dire le test de Welch). Pour les comparaisons multiples pour une mesure donnée parmi plus de 2 groupes, la procédure de Hommel (pour contrôler le taux global de faux positifs au niveau de 0,05) a été utilisée pour confirmer que les conclusions ne différaient pas considérablement, comme indiqué dans le tableau supplémentaire 3, en utilisant le package multxpert au sein de R (version 3.6.2 réf. 73 ). Les comparaisons pour plus de 2 groupes ont été effectuées en utilisant le test de rang de Kruskal-Wallis pour les données asymétriques. Une régression logistique multivariée a été réalisée après ajustement pour les variables cliniques et démographiques. Les variables ont été incluses dans le modèle multivariable si elles atteignaient le seuil de signification statistique dans l'analyse univariée (P = 0,10) et/ou s'ils ont été jugés cliniquement pertinents. Les variables incluses à des fins de comparaison qui répondaient à ces critères étaient l'âge, le sexe, l'obésité et la présence d'un cancer.

La zone sous le ROC du profil cfDNA a été calculée pour évaluer la capacité discriminante des patients COVID-19 par trajectoire clinique (besoin d'USI : échelle OMS 5-8 vs. non-USI : échelle OMS 1-4) et résultat (récupération : OMS échelle 1-7 vs décédé : échelle OMS 8). Les variables catégorielles ont été comparées avec le test exact de Fisher. Les corrélations entre les profils cfDNA et les marqueurs cliniques quantitatifs des lésions tissulaires ont été effectuées par la corrélation de Spearman (ρ). Le groupe de comparaison de sujets atteints de grippe et/ou de VRS a été apparié à des patients COVID-19 à l'aide de l'échelle de l'OMS pour comparer les mesures cfDNA totales et spécifiques aux tissus. Dans l'analyse de l'intensité du MitoSOX Red dans les cellules, les données sont indiquées en moyenne ± SEM. La signification statistique a été déterminée à l'aide du test de Kruskal-Wallis, suivi du test de Mann-Whitney pour 2 groupes ou du test de comparaison multiple de Tukey ou Dunnett. Une ANOVA à deux facteurs suivie du test de comparaison multiple de Tukey a été utilisée pour comparer les évolutions temporelles ou la dose-réponse. Les analyses statistiques ont été réalisées à l'aide de GraphPad Prism version 9 (et version 3.6.2 P les valeurs inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives, sauf indication contraire).

Approbation de l'étude. L'étude a été approuvée par les IRB de la faculté de médecine de l'Université Johns Hopkins, du centre médical de l'Université du Maryland et de l'hôpital Inova Fairfax. Les sujets de l'étude ont donné leur consentement éclairé pour la participation à l'étude à l'hôpital Johns Hopkins et à l'hôpital Inova Fairfax. L'IRB a approuvé une renonciation au consentement à l'Université du Maryland pour utiliser les échantillons excédentaires collectés pour des besoins cliniques.

TEA, NT, MKJ, PSTY, HK, RAS et SAE ont conçu des expériences. Données acquises TEA, NT, MKJ, HK, AC, SN et PSTY. FS, IT, KS et MP ont effectué des analyses bioinformatiques. TEA, NT et SAE ont écrit le manuscrit. SN et AC ont recruté des patients et fourni des échantillons et des données cliniques. TEA, FS, MP, NT, PSTY, SAE, RAS et KW ont effectué une analyse statistique. Tous les auteurs ont participé à la préparation du manuscrit et ont donné leur approbation finale pour la publication.

Cette recherche a été financée (en partie) par le programme de recherche intra-muros du NIH par le biais de la subvention intra-muros ciblée anti-COVID-19, NHLBI et NIDDK. SAE a également reçu un soutien par le biais du programme de recherche clinique NIH-Lasker, du programme NIH Distinguished Scholar et de la Cystic Fibrosis Foundation (subvention n° AGBORE20Q10). Les auteurs remercient Jeff M.Reece pour la configuration et les conseils sur la microscopie confocale. Les spécimens de COVID-19 utilisés pour cette publication faisaient partie de biodépôts établis à l'hôpital Johns Hopkins, au centre médical de l'Université du Maryland et à l'hôpital Inova Fairfax. Les auteurs apprécient les contributions dévouées des nombreux patients, équipes de recherche et cliniciens de Johns Hopkins, qui ont contribué à la création du bioréférentiel du consortium ECMO du University of Maryland Medical Center et du groupe COVID-19 du University of Maryland Medical Center. Nous remercions Wayne Pareanu pour son soutien éditorial. Cette recherche a été financée (en partie) par le programme de recherche intra-muros du NIH par le biais de la subvention intra-muros ciblée anti-COVID-19, NHLBI et NIDDK. Le Dr Agbor-Enoh a également reçu un soutien par le biais du programme de recherche clinique NIH-Lasker, du programme NIH Distinguished Scholar et de la Cystic Fibrosis Foundation (subvention AGBORE20Q10). SAE reçoit un financement de la Cystic Fibrosis Foundation.

Conflit d'intérêt: Les auteurs ont déclaré qu'il n'existe aucun conflit d'intérêts.

Droits d'auteur: © 2021, Andargie et al. Il s'agit d'un article en libre accès publié sous les termes de la licence internationale Creative Commons Attribution 4.0.


Résultats

Profilage de la taille de l'ADN plasmatique circulant par séquençage du génome entier.

Les bibliothèques de séquençage sont préparées à partir de DSP ou de SSP. Les deux méthodes fournissent des profils à partir desquels les variations peuvent être détectées et comparées, avec des tailles de cfDNA allant d'environ 30 à environ 1000 pb/nt (6, 31). La figure 1 montre les profils de taille de cfDNA de 7 individus humains sains obtenus à la fois par DSP-S et SSP-S. Pour tous les échantillons, nous avons obtenu une moyenne de 1 434 487 lectures (1 079 717 & 020131 611 205 lectures) pour le DSP et de 1 007 070 lectures (963 701𠄱 299 291 lectures) pour le SSP (Supplemental Figure 1 Supplemental Material disponible en ligne avec cet article https : //doi.org/10.1172/jci.insight.144561DS1). Le profilage de la taille du cfDNA à partir des 7 échantillons de plasma a révélé une très faible variation, car les 7 courbes se superposaient, quelles que soient les bibliothèques DSP-S ou SSP-S (Figure 1, A et B).

Profils de taille d'ADNcf de 7 individus sains, obtenus par séquençage à partir de préparations de bibliothèques d'ADN double ou simple brin (UNE et B, respectivement). Profils de taille moyenne des 7 individus, tels que déterminés par DSP-S (lignes noires) et SSP-S (lignes rouges) (C) courbes des fréquences cumulées entre SSP-S et DSP-S () la différence de fréquences cumulées, notée ΔS, entre SSP-S moins DSP-S (E) et la courbe de la différence des valeurs en %, notée ΔV, entre SSP-S moins DSP-S (F). La partie croissante de la courbe ΔS indique la plage de tailles de fragments, dans laquelle le nombre de fragments détectés SSP-S est proportionnellement plus élevé que les fragments détectés DSP-S tandis que la partie décroissante de la courbe ΔS indique la plage de tailles de fragments dans laquelle SSP -Le nombre de fragments détectés S– est proportionnellement inférieur à celui des fragments détectés DSP-S– (E). Les valeurs positives ΔV pour la taille du cfDNA indiquent où plus de fragments ont été détectés par SSP-S que par DSP-S (F). Les valeurs négatives de ΔV pour la taille du cfDNA indiquent où moins de fragments ont été détectés par SSP-S que par DSP-S. Plus de fragments sont détectés par SSP-S jusqu'à 158 pb (nt) par rapport à DSP-S, et plus de fragments sont détectés par DSP-S sur 158 pb (nt) (F).

Le profil DSP-S cfDNA des sujets sains avait une population monomodale majeure entre 80 et 260 pb, culminant à 166 pb avec environ 2,5 % de fragments totaux (figure 1A). Une population plus petite était également détectable entre 260 et 420 pb, allant de 8,0 % à 12,9 % du total des fragments (figure 1, A et B, et tableau supplémentaire 1A). Sous-pics des 7 échantillons colocalisés (tableau 1 et tableau supplémentaire 1B). Des lectures fiables étaient détectables jusqu'à 40 pb dans la plupart des échantillons.

Tableau 1

Le profil de taille SSP-S cfDNA des sujets sains avait une population comprise entre 45 et 260 pb, qui a culminé à 166 pb, correspondant à environ 2,0 % des fragments totaux. Les fragments ont plafonné entre 70 et 120 pb à environ 0,4% (figure 1B). Une très petite population a été observée entre 250 et 400 nt qui variait de 2,7 % à 4,5 % du nombre total de fragments (tableau supplémentaire 1). Tous les sous-pics des 7 échantillons colocalisés (tableau 1, tableau 2 et tableau supplémentaire 1B). Des lectures fiables étaient détectables jusqu'à la limite de détection de séquençage, environ 25 nt.

Tableau 2

Comme déterminé par DSP-S et SSP-S, le profil de taille de cfDNA a montré des divergences claires. Concernant la fraction allant jusqu'à 90 pb, ou de 90 à 240 pb, ou de 240 à environ 440 pb, les proportions de cfDNA étaient en moyenne de 0,1 %, 87,2 % et 12,7 %, respectivement, tel que déterminé par DSP-S et 8,0 %. , 87,2 % et 4,8 %, respectivement, tel que déterminé par SSP-S ( Figure 1 ). Les fragments de moins de 80 pb (nt) n'étaient détectables que par SSP-S (figure 1C et tableau supplémentaire 2). Entre 80 et 166 pb (nt), la proportion de fragments de cfDNA déterminée par séquençage d'ADN simple brin était légèrement plus élevée que pour le séquençage d'ADN double brin : 56,9 % et 41,5 %, respectivement (Tableau complémentaire 2A). Inversement, les valeurs SSP-S étaient légèrement inférieures dans la plage de 166 à 240 pb (nt), constituant 33,1 % du nombre total de fragments, par rapport aux valeurs DPS-S, qui constituaient 45,5 %. Il n'est pas possible de comparer le nombre de lectures dans les profils de taille SSP-S et DSP-S, mais les proportions respectives dans n'importe quelle plage de taille sont informatives (Figure supplémentaire 1).

Nous avons directement comparé les performances des 2 techniques de séquençage en examinant les données obtenues à partir de la différence de fréquences cumulées, notée ΔS, ou de la différence de fréquence des fragments, notée ΔV (Méthodes supplémentaires, Annexe 1). Au total, les données ont montré que SSP-S permettait la détection d'un nombre plus élevé de fragments de cfDNA par rapport à DSP-S et révélait un nombre plus élevé de fragments dans la plage de 45 à 158 pb (nt) et un nombre inférieur de fragments dans des plages allant de 158 à 250 pb (nt) et, dans une moindre mesure, 280 à 440 pb (nt).

Alors qu'un pic majeur de cfDNA et un pic très mineur étaient observables à environ 166 pb et environ 320 pb (Figure 1, A et B), il y avait également des sous-pics tous les 10 pb environ, en raison de la structure intime du cfDNA et de son association avec l'histone. octamères. Les tableaux 1 et 2 résument la détection de ces sous-pics dans le cfDNA individuel sain, provenant soit de SSP, soit de DSP. Les différentes techniques de séquençage ont produit des différences dans les sous-pics à des tailles de cfDNA spécifiques. Les différences entre les préparations de la bibliothèque comprenaient des sous-pics à 53, 63, 73, 83 et 94 pb qui n'ont été observés qu'avec SSP-S, et non avec DSP-S, alors qu'un sous-pic à 152 pb n'a été observé qu'avec DSP-S. Aucune périodicité n'a été détectée entre 145 et 167 pb lors de l'utilisation de SSP-S (tableaux 1 et 2). Notez également que les sous-pics dérivés du SSP-S sont environ 3 pb plus élevés que ceux du DSP-S.

Analyse de distribution de taille par Q-PCR.

Ensuite, nous avons utilisé des systèmes d'amorces Q-PCR imbriqués pour détecter des amplicons de 67, 145 et 320 pb, afin d'estimer la proportion des différentes fractions de taille de cfDNA dans les 7 échantillons (figure 2A). (Remarque : les concentrations de cfDNA indiquées ici concernent un KRAS région de l'ADN, et ne sont indicatives que de la concentration totale de cfDNA, comme indiqué dans la section Méthodes.) Cette technique pourrait détecter le cfDNA jusqu'à 67 pb. La fraction de cfDNA hautement fragmentée (HF, 67� pb) et la fraction de fragment de cfDNA dérivé de mononucléosome (MF, 145� pb) ont été détectées dans des proportions similaires (38 % et 39 %, en moyenne, respectivement), tandis que la fraction faiblement fragmentée (WF, 𾌠 pb) a été trouvée dans une proportion plus faible (23 % Figure 2A). Pour corroborer nos résultats, nous avons testé un panel de 109 individus en bonne santé (figure 2B). L'indice d'intégrité de l'ADN (DII) moyen de l'échantillon était de 0,134 ± 0,091 SD (Figure supplémentaire 2), indiquant que, pour les fragments de plus de 67 pb, environ 13,4% ont plus de 320 pb, ce qui confirme la fraction WF (19%) dérivée de la 7 échantillons mentionnés ci-dessus.

La distribution de taille fractionnelle a été réalisée à l'aide de systèmes d'amorces Q-PCR imbriqués pour détecter des amplicons de 67, 145 et 320 pb chez les 7 individus sains (Méthodes supplémentaires, Annexe 2). Notez que la distribution de taille fractionnaire telle que présentée ici a été obtenue à partir de concentrations de cfDNA quantifiées en ciblant le KRAS région de l'ADN et n'est qu'indicatif, comme décrit dans la section Méthodes. La distribution de la taille du cfDNA a été résumée en présentant les niveaux (les données représentent le ± SEM moyen) dans la fraction cfDNA hautement fragmentée (HF, 67� pb), les niveaux dans le cfDNA fragmenté dérivé du mononucléosome (MF, 145&# x02013320 pb), et une proportion plus faible (3%�%) dans le cfDNA faiblement fragmenté (WF, 𾌠 pb). (UNE). L'indice d'intégrité de l'ADN (DII) a été calculé sur la base de la détermination basée sur Q-PCR&# x02013 du rapport du nombre de fragments de plus de 320 pb à ceux de plus de 67 pb dans un KRAS région intron 3/exon 2 dans un panel de 109 individus sains (B). Le DII médian de l'échantillon était de 0,119. Barre, boîte médiane, 25 % à 75 % parenthèses, 5 % à 95 % voir Statistiques section dans Méthodes.

Comparaison du profil de taille du cfDNA plasmatique de sujets sains et de sujets atteints de CCR métastatique.

Il y avait très peu de variation dans les profils de taille du cfDNA des individus sains déterminés par chacune des 2 méthodes de séquençage (figure 1A). Pour cette raison, nous avons utilisé le profil de taille moyenne des sujets sains comme référence dans le reste de cette étude, lors de la comparaison de la fragmentation du cfDNA du cancer et du plasma sain.

Il y avait des différences subtiles mais fiables entre les profils de taille DSP-S de chacun des 7 patients atteints de cancer et la moyenne des 7 individus en bonne santé (Figure supplémentaire 3). Bien que les populations de fragments de cfDNA des sujets cancéreux et sains aient culminé à 166 pb, le plasma des patients cancéreux avait plus de fragments de cfDNA entre 40 et 150 pb et moins entre 150 et 260 pb. De plus, la courbe de profil montrait un épaulement entre 145 et 166 pb dans le plasma des patients cancéreux (figure 3, A, C, E, G et I et figure supplémentaire 3).

Séquençage à partir de préparations de banques d'ADN double ou simple brin (UNE et B, respectivement). La différence de fréquences de taille cumulée, notée ΔS, entre les échantillons de cancer individuels et la moyenne d'ADN sain telle que déterminée par DSP-S (C, E, g, et je) ou SSP-S (, F, H, et J). MAF des patients atteints de CCR métastatique (CCRm) : 68,5 % (C et ), 47.3% (E et F), 23.3% (g et H) et 0,9 % (je et J). Les profils de taille individuels et les courbes de fréquence de taille cumulée de chaque patient mCRC sont présentés dans les figures supplémentaires 3, 4, 6 et 7.

Les différences subtiles mais fiables similaires ont été observées par SSP-S (Figure 3, B, D, F, H et J et Figure supplémentaire 4) le plasma de patients cancéreux avait plus de fragments entre 30 et 145 nt et moins entre 145 et 260 nt, tandis que les deux populations ont culminé à 166 nt (figure 3). Notez que l'épaule observée chez les patients cancéreux (145� nt) était légèrement plus prononcée avec SSP-S, comme on peut le voir en comparant le profil de taille du cfDNA avec la fréquence d'allèles mutants (MAF) la plus élevée (Figure supplémentaire 4).

Le patient CCR numéro 8 avait le MAF le plus élevé (69%). La juxtaposition de leur profil de taille de cfDNA DSP-S ou SSP-S avec la ligne saine moyenne a illustré les différences globales de fragmentation de cfDNA entre les sujets sains et les patients mCRC (Figure 4, A et B). En utilisant DSP-S pour faire la même comparaison, les courbes de profil de taille respectives différaient considérablement. Les courbes des profils de taille DSP-S et SSP-S du plasma cancéreux semblaient être décalées vers une taille inférieure, tout en culminant à la même taille (166 pb) par rapport aux courbes d'individus sains (Figure 4, A et B) . Comme observé dans la figure 4, A et B, ainsi que dans les courbes ΔV (figure 1F et figure supplémentaire 5), la différence de fréquence entre le cancer et les sujets sains par DSP-S était positive dans les 40 à 150 et 220 à 320 pb (nt) et négatif dans la gamme 150 à 220 pb (Figure supplémentaire 5) pour SSP-S, il était positif dans les gammes 30 à 140 et 220 à 320 pb (nt) et négatif dans les 140 à 220 pb (nt) plage (Figure supplémentaire 5).

Comparaison du profil de taille du cfDNA de la moyenne d'un individu sain (ligne bleue) et d'un patient cancéreux avec un MAF de 68,5% (ligne noire), tel que déterminé par DSP-S (UNE) et SSP-S (B). Les lignes verticales indiquent les longueurs des fragments, là où la courbe du profil de taille du cfDNA moyen sain croise celle du cfDNA du patient cancéreux. Insérez, zoomez sur la plage de taille 240� bp (nt). Distribution de la taille, telle que déterminée par l'analyse Q-PCR à partir de la moyenne des 7 individus sains (bleu) et 7 cancéreux (noir), de l'HF (67� bp), MF (145� bp) et WF (� bp) x0003e320 pb) fractions (C). Notez que la distribution de taille fractionnaire telle que présentée ici a été obtenue à partir de concentrations de cfDNA quantifiées en ciblant le KRAS intron 3 et n'est qu'indicatif, comme décrit dans la section Méthodes. DII tel que déterminé en calculant le rapport de la fraction WF sur la concentration totale de cfDNA (㹧 pb) dans un KRAS région d'ADN de l'intron 3 (). Barre, boîte médiane, 25 à 75 % entre crochets, 5 à 95 %. Le niveau de signification a été évalué par les étudiants t test.

Qu'elles soient détectées par DSP-S ou SSP-S, les différences entre les sujets sains et cancéreux ont augmenté avec le MAF dans tous les échantillons de mCRC (Figure 3 et Figures supplémentaires 2, 3 et 5). Notez que plus le MAF est élevé, plus le nombre de fragments plus courts est grand et plus le pic à 166 pb est petit. La fraction moyenne de fragments de cfDNA dont la taille correspondait à celle des fragments de cfDNA emballés dans la structure di-nucléosome, était de 8 % à 12,9 % et de 2,5 % à 4,5 % dans le plasma sain, et de 3,2 % à 17,9 % et de 1,5 % à 9,5 %. chez les patients cancéreux (Tableau complémentaire 1), avec DSP-S et SSP-S, respectivement. En revanche, le pic associé aux dinucléosomes était significativement différent dans le plasma de patients sains et cancéreux (

332 contre environ 300 pb et environ 327 contre environ 303 nt, tels que détectés par DSP-S et SSP-S, respectivement). Comme dérivé de l'analyse DSP-S, le rapport de fréquence de taille de fragment de 166 pb/145 pb a montré un pouvoir discriminant entre les échantillons sains (3,1 &# x000b1 0,33 SD) et les 7 échantillons de mCRC (1,0 à 3,29 Tableau supplémentaire 2A). En utilisant l'analyse SSP-S, le rapport de fréquence de taille de fragment de 166 pb/145 pb était de 1,58 à 0,10 et variait de 0,77 à 2,05 dans les échantillons sains moyens et les 7 échantillons de CRC, respectivement (tableau supplémentaire 2A). De plus, en utilisant l'analyse DSP-S, la fréquence de taille des fragments de la plage de 30 à 145 pb, comparée à la taille totale des fragments de la plage de 30 à 440 pb (correspondant à l'ADN dans les mono- et di-nucléosomes), a montré un pouvoir discriminant. entre les échantillons sains (13,40 ± 0,02 SD) et les 7 échantillons CRC (17,35 à 44,05). En utilisant l'analyse SSP-S, la fréquence de taille des fragments de la plage de 30 à 145 pb était de 33,08 à 0,02 et de 28,05 à 60,38 dans les échantillons sains moyens et les 7 échantillons de CRC, respectivement (tableau supplémentaire 2A).

L'observation du graphique de distribution de la taille des fréquences de taille cumulées, et le ΔS, ou ΔV, entre les échantillons de cancer individuels et la moyenne cfDNA sain, nous a permis d'affiner la différence entre la moyenne saine et chaque patient cancéreux ( Figure 3 , Tableau supplémentaire 2 et figures supplémentaires 5𠄷). Notez que cette différence au sommet a augmenté à mesure que le MAF augmentait (0,9 %, 3,2 %, 14,3 %, 23,3 %, 47,3 %, 54,6 % et 68,5 %). Ainsi, la différence de valeur maximale de ΔS était la plus faible pour les cas de CCRm avec le MAF le plus faible, en utilisant soit le DSP-S (5 %, 15 %, 24 % et 34 %) soit le SSP-S (0, 8, 18 et 26 % Figure 3 et Figures supplémentaires 6 et 7). Néanmoins, l'aire sous la courbe ΔS est apparue plus élevée, lors de l'examen du profil de taille, dans l'analyse SSP-S que dans l'analyse DSP-S (Figure 3 et Figure supplémentaire 8). De plus, le ΔS à 155 pb (nt) variait de 3,9 % à 31,80 % et de 𠄵,70% à 24,9 % (en utilisant DSP-S et SSP-S, respectivement), et apparaissait comme un facteur discriminatoire lorsque l'on compare le cancer et les individus en bonne santé (tableau supplémentaire 2B). La figure 5 illustre que la fréquence des fragments de cfDNA dans des plages de tailles spécifiques est en corrélation avec le MAF. Le pourcentage de fragments de la plage de tailles de 30 pb ou 30 t 02013143 a augmenté avec un MAF élevé tel que déterminé par DSP-S et SSP-S, respectivement le pourcentage de fragments de la plage de tailles de 151 pb ou 143 t x02013220 a diminué avec un MAF élevé , tel que déterminé par DSP-S et SSP-S, respectivement (Figure 5).

Pourcentage de fragments déterminé par DSP-S (UNE et C) et SSP-S (B et ) dans les 30� pb (UNE), 30� nt (B), 151� pb (C), et 143� nt () varie de taille dans la population totale de fragments de cfDNA par rapport à la moyenne des individus sains (m = 7) et de patients atteints d'un seul cancer de divers MAF. La figure ne présente que la plage de tailles dans laquelle la proportion de fragments de cfDNA a montré une variation la plus élevée entre la moyenne saine et le patient avec le MAF le plus élevé (68,6%).

Des observations similaires peuvent être faites en relation avec le calcul de ΔV. Pour les analyses DSP-S et SSP-S, les pics de courbe positifs et négatifs ΔV diminuaient avec la diminution du MAF, jusqu'à presque aucune différence (ଐ,2% à MAF = 0,9%, ΔV) (supplémentaire graphique 5). Dans l'ensemble, les données ont montré que plus le MAF augmentait, plus il y avait de différences observables dans le profil de taille et les courbes ΔS et ΔV (Figure supplémentaire 5). Lors de la comparaison du cancer et du plasma individuel sain, des différences significatives ont été observées dans les données ΔS et ΔV lorsque les valeurs dérivées du DSP-S– ont été soustraites des valeurs dérivées du SSP-S– (Figures supplémentaires 5 et 8). De plus, le ΔV de la plage de tailles de 40 à 160 pb (nt) variait de 3,32 % à 29,96 %, et de 𠄶,13 % à 22,05 %, en utilisant DSP-S et SSP-S, respectivement & #x00394V est également apparu comme un facteur discriminatoire lors de la comparaison du cancer et des individus en bonne santé (Figure supplémentaire 5 et Tableau supplémentaire 2). De plus, ΔV calculé dans la plage de 40 à 160 pb (nt) de la moyenne de 7 plasmas sains était de 22,04 ± 0,68 SD % et ΔV du plasma des 7 patients atteints de CCR variait de 12,27 % à 16,68 %. (Figure supplémentaire 5 et tableau supplémentaire 2B).

À des tailles de cfDNA spécifiques, il y avait un certain nombre de différences dans la présence de sous-pics entre le cancer et les individus sains, selon que l'analyse DSP-S ou SSP-S était utilisée.Ceux-ci peuvent être résumés comme suit : la DSP-S a montré des sous-pics à 71, 81 et 91 pb chez les sujets cancéreux (tableau supplémentaire 3) contrairement aux sujets sains (tableau 1). sujets (tableau 1), contrairement aux sujets cancéreux (tableau supplémentaire 3).

La distribution de taille fractionnelle déterminée par Q-PCR a révélé que, contrairement au plasma de sujets sains, les échantillons de plasma de patients CCRm présentaient un nombre plus élevé de fragments dans la fraction HF que dans la fraction MF et un niveau très faible (

1 %) dans la fraction WF (figure 4C). Pour corroborer nos résultats liés au DII, calculé pour les 7 patients mCRC, nous avons utilisé un panel de 104 patients mCRC (Figure 4D et Figure supplémentaire 2). Chez les patients atteints de CCR, le DII moyen était de 0,004. Cela signifie que 0,4 % étaient supérieurs à 320 pb et, étant donné qu'aucun fragment de plus de cette taille n'est détectable jusqu'à

1000 pb par WGS, que 0,4% étaient supérieurs à environ 1000 pb. Ainsi, le DII de la cohorte saine (moyenne DII, 0,13) était significativement plus élevé que le DII des patients atteints de CCR de tous les stades (P < 0,0001 Figure 2 et Figure supplémentaire 2).


Recherche clinique sur la biopsie liquide - Suivi des mutations dans le cfDNA et les CTC

Les progrès technologiques, tels que les solutions automatisées de bout en bout, permettent aux chercheurs cliniques d'étudier des échantillons de biopsie liquides difficiles. Les leaders dans le domaine ont conçu des tests de séquençage de nouvelle génération (NGS) qui ciblent des questions critiques dans la recherche sur le cancer et la biologie des tumeurs.

Nous avons récemment rencontré le Dr Luca Quagliata, MD, de l'hôpital universitaire de Bâle, en Suisse. Nous avons discuté du suivi des mutations dans le cancer de la prostate métastatique à l'aide d'ADN acellulaire (cfDNA) et de cellules tumorales circulantes (CTC). Une partie de notre conversation comprenait des détails sur le protocole qu'il utilise pour effectuer une analyse NGS sur 20 à 30 ng d'ADN qu'il obtient à partir d'un échantillon de sang de départ de 10 ml à l'aide de la plate-forme LiquidBiopsy ™.

Le Dr Quagliata a expliqué que nombre de ses collègues européens s'orientent vers le séquençage ciblé à l'aide de tests multi-cibles, car ensemble, les NGS et les tests ciblés fournissent tous les détails nécessaires. « Nous pouvons examiner le paysage des mutations d'une tumeur primaire pour comprendre la complexité », a-t-il déclaré. « En regardant des échantillons de sang successifs provenant de la même source, nous voyons la mutation BRCA diminuer au fil du temps et l'augmentation des mutations dans la tumeur - PIK3CA et plus tard, MET. Ces changements dans le profil mutationnel suggèrent que ce type d'échantillon peut éclairer la sélection future d'une thérapie. »

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Pour la recherche uniquement. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.


Voir la vidéo: Lääketieteen perustutkimuksesta käytäntöön mitä hyötyä on tutkimuksesta? Professori Juha Kere (Décembre 2021).